论文部分内容阅读
目的:本实验制备前脑缺血/再灌注模型是采用夹闭C57/BL6小鼠两侧颈总动脉(BACCO)法,并于脑缺血前行重复电针刺激,处理完成后观察小鼠脑缺血/再灌注后海马Rheb、mTOR、p-mTOR、LC3-Ⅱ蛋白的表达、神经行为学评分及神经元凋亡情况和凋亡蛋白caspase-3蛋白的表达。探讨mTOR信号通路在脑缺血再灌注过程中所发挥的作用以及电针预处理产生脑保护作用的可能机制,为临床上防治缺血性脑疾病提供了新的理论依据。方法:12周龄健康青年雄性C57/BL6小鼠36只,体重22-25g,按随机数字表法分为3组(n=12):假手术(S)组、脑缺血/再灌注(I/R)组及电针百会穴预处理组(EA)组。采用夹闭双侧颈总动脉法后再灌注72h制备前脑缺血/再灌注模型,S组:只分离双侧颈总动脉,I/R组及EA组均采用夹闭双侧颈总动脉(BCCAO)15min后再灌注72h的方法建立小鼠短暂性脑缺血/再灌注模型。EA组于夹闭双侧颈总动脉前接受电针预处理百会穴30min/d,连续5d,2/15Hz疏密波,强度1mA。脑缺血/再灌注72h后对所有小鼠进行神经行为学评分,每组随机取6只行甲醛固定后制作石蜡切片,HE染色观察海马CA1区神经元的形态,TUNEL法检测海马CA1区凋亡的神经元,每组其余的6只取新鲜海马组织,Western blot法检测海马Rheb、mTOR、p-mTOR、LC3-Ⅱ及caspase-3蛋白的表达。结果:1.小鼠脑缺血/再灌注72h后,与假手术(S)组相比,脑缺血/再灌注(I/R)组神经行为学评分显著升高(P<0.05);电针预处理(EA)组与缺血/再灌注(I/R)组相比神经行为学评分降低(P<0.05)。2.HE染色发现,假手术(S)组海马CA1区的神经元结构及形态大致正常,仅有少量神经元变性;脑缺血/再灌注(I/R)组海马CA1区正常神经元显著减少,有大量的变性细胞,但电针预处理(EA)组与其相比,神经元结构及形态的损伤程度减轻,正常神经元增多。TUNEL法染色发现,假手术(S)组海马CA1区仅有少量凋亡神经元,脑缺血/再灌注(I/R)组凋亡细胞数明显增多,且与假手术(S)组组相比,差异具有明显的统计学意义;与脑缺血/再灌注(I/R)组相比,电针预处理(EA)组的凋亡细胞数减少,且差异具有统计学意义。3.Western blot法检测发现,与假手术(S)组相比,脑缺血/再灌注(I/R)组海马区Rheb、mTOR、p-mTOR、LC-Ⅱ及caspase-3蛋白的表达升高,且差异具有统计学意义(P<0.05);与脑缺血/再灌注(I/R)组相比,电针预处理(EA)组海马区Rheb、mTOR、p-mTOR表达升高,LC3-Ⅱ蛋白、caspase-3蛋白的表达降低,且差异具有统计学意义(P<0.05)结论:1.脑缺血/再灌注损伤后,小鼠脑海马区Rheb、mTOR、p-mTOR、LC3-Ⅱ蛋白表达增多,说明mTOR、自噬可能在脑缺血/再灌注过程中发挥着重要的作用。2.电针预处理能够使小鼠脑海马区Rheb、mTOR、p-mTOR蛋白表达增多,LC3-Ⅱ、caspase-3蛋白表达降低,神经元凋亡数减少,表明电针预处理发挥脑保护效应可能是通过激活mTOR、抑制自噬产生的。