肥胖呈慢性低度炎症状态,可导致胰岛素抵抗,并可引起高血压、高血脂、动脉粥样硬化、2型糖尿病等等。脂肪组织分泌的促炎及抗炎脂肪细胞因子失衡参与了肥胖相关的慢性炎症状态的诱发和维持,并促进了肥胖相关的胰岛素抵抗的发展。肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF-a)是脂肪组织分泌的脂肪细胞因子之一,并以跨膜型(tmTNF-α)和分泌型(sTNF-α)两种活性形式存在。sTNF-α已被广泛认为是连接肥胖和胰岛素抵抗的重要分子之一,通过多种分子机制促进胰岛素抵抗,但迄今tmTNF-α对胰岛素抵抗的影响仍知之甚少。本研究旨在探讨tmTNF-α对肥胖诱发的胰岛素抵抗的影响及其分子机制,为肥胖/胰岛素抵抗的干预和治疗提供新的线索。主要结果如下：第一部分外源性tmTNF-α通过TNFR2介导的正向信号促进脂肪细胞对胰岛素的敏感性诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞后,用两型TNF-a直接刺激脂肪细胞24小时,检测胰岛素信号通路、促炎及抗炎脂肪细胞因子的产生及其分子通路。一、外源性tmTNF-α促进3T3-L1及人原代脂肪细胞对胰岛素的敏感性1. tmTNF-α促进脂肪细胞对胰岛素的应答：氚标记的脱氧葡萄糖摄取实验结果表明：与sTNF-α抑制脂肪细胞葡萄糖摄取的效应相反,tmTNF-α促进脂肪细胞对胰岛素的应答,明显增加对葡萄糖的摄取,经TNF-α抗体预处理可阻断这一胰岛素增敏效应。2.外源性tmTNF-α直接促进脂肪细胞的胰岛素信号通路：Western blot实验结果表明：与sTNF-α作用相反,tmTNF-α明显促进胰岛素刺激下胰岛素信号通路关键分子IRS-1的酪氨酸磷酸化和Akt磷酸化,即增强胰岛素信号转导。3.外源性tmTNF-α促进脂肪细胞GLUT4的表达及膜转位：Western blot实验结果表明：与sTNF-α作用相反,tmTNF-α明显促进GLUT4蛋白的表达,并促进胰岛素刺激下GLUT4从胞浆至胞膜的转位。上述结果提示tmTNF-α可直接促进胰岛素信号转导,提高脂肪细胞对胰岛素的应答。二、外源性tmTNF-a通过抑制NF-kB通路下调促炎细胞因子1.外源性tmTNF-α抑制NF-κB活化：本室前期已证实：与sTNF-α的促进作用相反,tmTNF-α可抑制促炎脂肪细胞因子IL-6和MCP-1的基因转录和蛋白表达。由于IL-6和MCP-1均为NF-κB的靶基因,用Western blot观察两型TNF-α对NF-κB活化的影响。结果显示：与sTNF-α的促进作用相反,tmTNF-α明显抑制IκB-α降解,使p65核转位减少,胞浆p65增加,提示抑制NF-κB活化。2.外源性tmTNF-α通过A20抑制NF-κB通路：用Real time RT-PCR检测NF-κB信号通路负反馈调节分子A20mRNA证实两型TNF-α均可诱发A20基因表达。用siRNA阻断A20的表达可促进sTNF-α对脂肪细胞IκB-α的降解,却完全解除tmTNF-α对其的抑制效应；且siA20可明显促进sTNF-α上调IL-6和MCP-1mRNA的转录,却阻断tmTNF-α下调3T3-L1脂肪细胞对二者基因的转录。上述结果提示tmTNF-α通过A20抑制NF-κB活化,从而下调促炎脂肪细胞因子IL-6和MCP-1的产生,进而间接促进脂肪细胞对胰岛素的敏感性。三、外源性tmTNF-α通过PPAR-γ促进脂肪细胞表达胰岛素促敏分子脂联素1.外源性tmTNF-α促进脂联素的产生：用ELISA证实,与sTNF-α作用相反,tmTNF-α可促进抗炎脂肪细胞因子脂联素的产生和分泌。2.外源性tmTNF-α通过PPAR-γ促进脂联素表达以及增加胰岛素敏感性：本室前期已证实tmTNF-α明显促进脂肪细胞表达脂联素转录因子PPAR-γ。用PPAR-γ的活性抑制剂GW9662可阻断tmTNF-α诱导的脂联素mRNA的转录；本研究用葡萄糖摄取实验进一步证实,GW9662可完全阻断tmTNF-α促进胰岛素刺激下脂肪细胞对葡萄糖的摄取。上述结果提示tmTNF-α通过PPAR-γ促进脂联素表达,进而提高脂肪细胞对胰岛素的敏感性。四、外源性tmTNF-α:通过TNFR2发挥胰岛素增敏效应用TNFR1和TNFR2封闭抗体分别预处理3T3-L1脂肪细胞,再用两型TNF-a处理脂肪细胞24h,结果表明：1.外源性tmTNF-α通过TNFR2促进胰岛素敏感性：用抗体封闭TNFR1可完全阻断sTNF-α抑制胰岛素诱导的脂肪细胞摄取葡萄糖,用抗体封闭TNFR2可完全阻断tmTNF-α对胰岛素刺激下葡萄糖摄取和IRS-1酪氨酸磷酸化的促进作用；2.外源性tmTNF-α通过TNFR2下调炎症反应：用抗体封闭TNFR1可完全阻断sTNF-α促进IL-6mRNA的表达,而用抗体封闭TNFR2则可完全解除tmTNF-α抑制IL-6基因转录以及抑制IκB-α降解的效应；3.外源性tmTNF-α通过TNFR2上调抗炎反应：用抗体封闭TNFR1可大部分逆转sTNF-α对脂联素mRNA表达的抑制效应,而用抗体封闭TNFR2则可完全阻断tmTNF-α对脂联素mRNA和PPAR-γ蛋白表达的促进效应。上述结果提示tmTNF-α是通过TNFR2提高脂肪细胞对胰岛素的敏感性的。第二部分tmTNF-α抗体对高脂饮食诱导肥胖小鼠的影响一、体外检测tmTNF-α抗体的特异性前期制备了兔抗鼠tmTNF-α多克隆抗体,ELISA检测结果表明：该抗体与tmTNF-α抗原肽产生特异性结合,而不与sTNF-α发生交叉反应；用该抗体与Western Blot分离蛋白染色：只在26kD处检测到tmTNF-α,而不能检测到17kD的sTNF-α; FACS结果表明：tmTNF-α抗体可提高3T3-L1细胞表面tmTNF-α的表达。二、确定tmTNF-α抗体治疗剂量为确定tmTNF-α抗体用于体内治疗的剂量,用不同剂量的抗体腹腔注射C57BL/6小鼠,24小时后检测附睾脂肪及骨骼肌组织中tmTNF-α的表达情况。免疫组化结果证明：400μg抗体即可有效增加tmTNF-α在脂肪和骨骼肌组织中的表达；Western blot结果表明：600μg抗体使脂肪和骨骼肌组织中tmTNF-α的表达明显升高。故确定600gg为抗体体内的用量。三、tmTNF-α抗体对高脂饮食诱导肥胖小鼠tmTNF-α酶解的影响高脂饮食(HFD)喂养2周后,开始给予C57BL/6小鼠兔抗鼠tmTNF-α纯化抗体体内治疗,每周三次,每次600μg经腹腔注射,共持续12周,同时设置正常饮食对照、HFDPBS和HFDIgG对照。1. tmTNF-α抗体对高脂饮食诱导肥胖小鼠脂肪组织tmTNF-α表达的影响：免疫组化和Western blot结果显示高脂饮食导致肥胖小鼠脂肪组织表达tmTNF-a轻度增加,但tmTNF-a抗体却使之表达明显增加。2. tmTNF-a抗体对高脂饮食诱导肥胖小鼠骨骼肌组织tmTNF-a表达的影响：免疫组化和Western blot结果显示肥胖小鼠骨骼肌组织表达tmTNF-a增加,而tmTNF-a抗体却使之表达进一步增加。3. tmTNF-a抗体对高脂饮食诱导肥胖小鼠肝脏组织tmTNF-a表达的影响：免疫组化和Western blot结果显示肥胖小鼠肝组织表达tmTNF-a有所增加,而tmTNF-a抗体却使之表达进一步增加。4. tmTNF-a抗体对高脂饮食诱导肥胖小鼠血浆sTNF-a水平的影响：CBA检测结果显示肥胖导致血浆sTNF-a水平明显升高,而tmTNF-a抗体则完全抑制肥胖诱导的sTNF-a分泌。上述实验结果提示tmTNF-a抗体在体内可明显阻断tmTNF-a被酶解为sTNF-a,使糖代谢重要的脂肪、骨骼肌和肝组织表达tmTNF-a增加,以便观察tmTNF-a对肥胖小鼠糖脂代谢与胰岛素抵抗的影响。四、 tmTNF-α抗体对高脂饮食诱导肥胖小鼠脂代谢的影响1. tmTNF-α抗体对高脂饮食诱导肥胖小鼠体重的影响：体重增长曲线显示：从HFD喂养2周后小鼠体重均明显高于正常饮食对照组,且mTNF-α抗体对HFD导致体重增长无影响。抗体治疗12周结束后,抗体治疗组与HFD对照组的体重之间亦无差异。2. tmTNF-α抗体对高脂饮食诱导肥胖小鼠脂肪重量的影响：小鼠附睾脂肪组织重量结果显示,HFD使小鼠脂肪重量明显增加,tmTNF-α抗体使肥胖小鼠脂肪组织重量进一步增加。脂肪组织HE染色显示：HFD使小鼠脂肪细胞体积明显增大,可见明显的炎性细胞浸润,tmTNF-α抗体组中脂肪细胞体积更大,但炎性细胞浸润明显减轻。3. tmTNF-α抗体对高脂饮食诱导肥胖小鼠肝脏的影响：肥胖小鼠肝脏重量明显增加,肝细胞出现脂肪变性,细胞体积增大,细胞核周围出现脂肪空泡,可被油红O染为红色,且转氨酶ALT和AST明显升高；应用tmTNF-α抗体则使肥胖小鼠肝脏重量明显减轻,肝脂肪变性得到明显改善,ALT和AST恢复正常。4. tmTNF-α抗体对高脂饮食诱导肥胖小鼠血脂的影响：肥胖小鼠血浆中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、HDL、LDL水平均增高,tmTNF-α抗体可明显降低肥胖小鼠的TG和LDL水平,进一步使HDL水平增高,但对其高胆固醇血症无明显影响。五、 tmTNF-α抗体对高脂饮食诱导肥胖小鼠糖代谢的影响1. tmTNF-α抗体对高脂饮食诱导肥胖小鼠空腹血糖和胰岛素的影响：肥胖小鼠空腹血糖水平基本正常,然而空腹血浆胰岛素水平却明显升高；应用tmTNF-α抗体可改善肥胖导致的高胰岛素血症,却使血糖水平进一步增高。2. tmTNF-α抗体对高脂饮食诱导肥胖小鼠葡萄糖耐量及胰岛素耐量的影响：肥胖小鼠具有明显的葡萄糖耐量和胰岛素耐量的降低,tmTNF-α抗体治疗尽管不能改善肥胖小鼠葡萄糖耐量的异常,却可部分提高胰岛素敏感性,提示tmTNF-α抗体导致的高糖血症主要与胰岛素产生相对不足有关。3. tmTNF-α抗体对高脂饮食诱导肥胖小鼠胰腺的影响：肥胖小鼠胰岛体积增大、insulin染色阳性细胞数量增多,而tmTNF-α抗体治疗则明显抑制肥胖导致胰岛代偿性肥大以及p细胞代偿性增生。进一步检测证实tmTNF-α抗体可促进胰岛tmTNF-α的表达,提示该抗体可能导致胰岛细胞凋亡。TUNEL染色证实tmTNF-α抗体的确导致胰腺凋亡细胞增多,这可能是胰岛代偿不足的原因。4. tmTNF-α抗体对高脂饮食诱导肥胖小鼠不同组织表达GLUT4的影响：Western blot结果显示：肥胖小鼠脂肪和骨骼肌组织膜蛋白中的GLUT4明显减少,tmTNF-α抗体则明显促进肥胖小鼠脂肪和骨骼肌组织GLUT4在细胞膜的表达,并诱导肝组织细胞膜中表达少量GLUT4。六、tmTNF-α抗体对高脂饮食诱导肥胖小鼠血浆促炎及抗炎细胞因子的影响应用CBA法检测了小鼠血浆中促炎细胞因子IL-6、MCP-1和抗炎细胞因子脂联素的含量,结果显示：肥胖小鼠血浆中IL-6和MCP-1的水平明显升高,而脂联素的水平则明显下降；tmTNF-α抗体导致上述促炎细胞因子水平恢复正常,并完全阻断肥胖诱导的脂联素降低。第三部分肥胖患者脂肪组织跨膜型TNF-α转换的特点一、正常及肥胖病例腹部皮下脂肪组织中TNF-α的表达从同济医学院附属同济医院手术室收取正常体重(BMI≤25kg/m2)和肥胖病例(BMI≥30kg/m2)的腹部皮下脂肪组织,Western Blot结果显示：肥胖患者脂肪组织总蛋白中TNF-α的表达明显高于正常体重组(p<0.05)。用统计学软件分析了12例正常体重和9例肥胖病例(共计21例)的腹部皮下脂肪组织中TNF-α的表达与BMI的相关性,结果表明：脂肪组织TNF-α的表达水平与BMI具有正相关性(r=0.6519,P<0.01)。二、正常及肥胖病例腹部皮下脂肪组织膜蛋白中tmTNF-α的表达和脂肪组织匀浆中sTNF-α的分泌Western Blot和ELISA结果表明：肥胖病例脂肪组织膜蛋白中tmTNF-α的表达以及脂肪组织匀浆中sTNF-α的含量均明显高于正常体重组(p<0.01)。三、人腹部皮下脂肪组织中TACE的活性与表达荧光底物法检测人腹部皮下脂肪组织中TACE的活性,用Western Blot检测其表达,结果表明：肥胖病例组脂肪组织中TACE的表达(p<0.05)及其活性(p<0.01)均明显高于正常体重组。提示肥胖患者TACE的表达和活性增高,是tmTNF-α转换增加的分子机制。四、人腹部皮下脂肪组织中timp-3的表达Western Blot检测人腹部皮下脂肪组织中TACE抑制分子timp-3的表达,结果显示：肥胖病例组脂肪组织表达timp-3明显低于正常体重组(p<0.001)。提示肥胖患者timp-3的低表达可能是TACE活性增高的原因。结论：tmTNF-α可通过TNFR2直接促进胰岛素信号转导和GLUT4的表达与膜转位,促进脂肪细胞摄取葡萄糖；并通过A20抑制NF-kB活化,进而抑制促胰岛素抵抗分子IL-6和MCP-1的表达,通过PPAR-γ促进胰岛素促敏分子脂联素的表达,进而间接促进脂肪细胞对胰岛素的敏感性。tmTNF-α抗体在体内可有效抑制tmTNF-α转换为sTNF-α,使脂肪、骨骼肌、肝和胰腺组织表达tmTNF-α增加,进而改善肥胖诱导的脂代谢异常,发挥抑炎效应,部分缓解肥胖诱导的胰岛素抵抗。但该抗体可诱导肥胖小鼠胰腺细胞凋亡,使胰岛代偿功能不足,引起高血糖症。与动物模型一致,肥胖患者腹部皮下脂肪组织中tmTNF-α表达增高,而脂肪组织匀浆分泌sTNF-α增加,提示tmTNF-α转换增强；而肥胖患者脂肪组织TACE的表达及活性升高,且其活性抑制分子timp-3表达降低,是tmTNF-α转换增强的原因。