淋巴道转移是恶性实体瘤、特别是上皮源性的恶性肿瘤的转移主要途径，也是恶性肿瘤患者术后复发转移的重要原因。探讨肿瘤淋巴管形成与肿瘤转移的关系不仅具有重要的理论意义，而且抗肿瘤淋巴管生成也可望成为抗肿瘤转移的新治疗靶点。食管癌是常见的消化道恶性肿瘤，严重危害人类的生命及健康。食管癌的发病机制迄今尚不完全明确。由于食管癌的早期临床症状不甚明显，故多数患者在确诊时已达癌症的中晚期，且多发生了淋巴道转移，治疗效果往往欠佳。因此，探讨食管癌淋巴管生成与肿瘤转移的关系，并研究以抗淋巴管生成为靶点，进而阻断肿瘤转移的发生，具有十分重要临床意义及应用前景。血管内皮生长因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）及其受体血管内皮生长因子受体-3（vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3），亦称Flt-4，是近年来发现的淋巴管生长因子，在促进淋巴管生成方面起十分重要的作用。VEGFR-3属于内皮受体型酪氨酸蛋白激酶，由芬兰学者Pajusola等在1992年从人的胚胎和白血病细胞cDNA文库中克隆得到，位于第5号染色体长臂5q33～q35区带上，是一个高度糖基化的单链跨膜蛋白，其分子量为180 kD。在胚胎期是胚胎血管形成的必需因素，在血管及淋巴管内皮细胞均有分布，而在成人则仅于淋巴管内皮细胞中表达。VEGF-C是1996年芬兰学者Pajusola和Joukov等从人类前列腺癌细胞株PC-3的cDNA文库中克隆并分离出来的一种分泌型糖蛋白，它是VEGFR-3的配体，与VEGF（亦称VEGF-A）享有同源区域。人VEGF-C基因位于染色体4q34上，编码产物为419个氨基酸残基的蛋白，相对分子质量为4.69kD，可在正常人体心脏、胎盘和肌肉等组织中有弱表达，而在肿瘤细胞中呈较强阳性表达。近年来的研究发现，肿瘤细胞可产生大量VEGF-C，并可通过VEGF-C／VEGFR-3自分泌或旁分泌途径与受体VEGFR-3结合，引起VEGFR-3的激活，使受体自身磷酸化，通过细胞质内信息传递，使有丝分裂增加，诱导淋巴管内皮细胞增殖，从而使淋巴管扩张或增生，形成新生的淋巴管，增加了肿瘤淋巴道转移的机会。瑞士学者Mandriota等利用转基因小鼠研究了VEGF-C对肿瘤淋巴管生成的影响，结果发现在形成的双转基因小鼠体内，肿瘤周围既有丰富的淋巴管形成，并常可发生胰腺淋巴结转移，表明VEGF-C促进了肿瘤周边淋巴管的发育，且与淋巴结转移率呈正相关，提示VEGF-C诱导的淋巴管生成可以介导肿瘤细胞的转移。美国学者Skobe等发现原位移植于裸鼠的人乳腺癌移植瘤中存在着瘤内淋巴管生成，瘤细胞的VEGF-C过表达导致瘤内淋巴管生成，引起区域淋巴结转移和肺转移的增加。日本学者Kinoshita等提出，能够诱导淋巴管生成的VEGF-C在乳腺癌中的过表达与乳腺癌淋巴道转移显著相关，VEGF-C阳性乳腺癌患者的5年生存率明显低于阴性组。但也有少数学者认为，在乳腺癌组织中没有分化的淋巴管，未分化的淋巴管多存在于肿瘤周围，且与肿瘤的大小、组织学分级和淋巴结转移状况无关，而淋巴管的密度与肿瘤的侵袭性呈负相关，并认为乳腺癌的淋巴结转移可能通过预先存在的淋巴管实现。近年来，RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术的发现，为肿瘤的基因治疗提供了一种新的思路。通过RNAi技术抑制癌基因的表达，有可能成为肿瘤基因治疗的新策略，具有较好的应用前景。由于该技术具有高效性和高度特异性，既能高效、特异地阻断目的基因的表达，而对其他正常基因无影响。因此RNAi技术已成为当前研究基因功能的、病毒感染性疾病、遗传性疾病及肿瘤基因治疗等方面新的技术手段。文献检索表明，有关VEGF-C及其受体VEGFR-3在食管鳞癌组织表达情况的研究仅见数篇文献，而应用VEGF-C特异性短小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）真核表达载体，转染并成功导入人食管癌EC9706细胞，进而检测转染后的EC9706细胞中VEGF-C基因沉默改变情况的研究，国内外均未见文献报道。为了探讨VEGF-C和VEGFR-3在食管鳞癌组织中的表达，并从体内、外两个方面采用RNAi技术，探究抗肿瘤淋巴管生成在肿瘤基因治疗中的意义，本研究进行了以下系统性研究。采用免疫组织化学、RT-PCR、原位杂交（in situ hybridization，ISH）等技术，分别检测49例高发地区食管鳞癌组织、23例癌旁不典型增生组织及49例正常黏膜中VEGF-C和VEGFR-3的表达程度，探讨食管癌中VEGF-C及其受体与淋巴管生成的相关性；应用RT-PCR检测人食管癌EC9706细胞VEGF-C mRNA表达，并根据VEGF-C在人食管癌EC9706细胞表达的特点，采用RNA干扰技术，自行构建针对VEGF-C的pSINsi-U6-siRNA真核表达载体，应用阳离子脂质体介导，将其成功转染导入EC9706细胞。进而应用免疫组化、RT-PCR、ISH和流式细胞技术等技术，观察转染了siRNA质粒的人食管癌EC9706细胞的生长特性、细胞增殖、细胞周期变化及VEGF-C表达，从体外实验的角度观察siRNA对EC9706细胞中VEGF-C表达水平的抑制作用；在体外实验的基础上，本研究构建裸鼠人食管癌移植瘤动物模型，将转染了针对VEGF-C的siRNA表达载体的EC9706细胞种植于裸鼠皮下，形成人食管癌EC9706细胞移植瘤，观察移植瘤的生长变化，并应用免疫组化、RT-PCR和ISH等技术，分别检测移植瘤组织中VEGF-C表达水平，从体内实验的角度验证移植瘤组织中VEGF-C表达的抑制作用。通过以上实验，试图阐明VEGF-C和VEGFR-3在人食管鳞癌的表达特征；发现人食管癌EC9706细胞系中VEGF-C基因表达情况；进一步探讨采用特异性RNAi抑制VEGF-C基因后，EC9706细胞中VEGF-C基因表达特点与肿瘤细胞生长、细胞增殖、细胞周期等变化，以及RNAi抑制VEGF-C基因表达后在整体水平对裸鼠移植瘤生长、VEGF-C基因表达等的影响，为进一步了解VEGF-C基因在食管癌发展中的作用，并为食管癌抗淋巴管生成治疗，提供新的实验基础和理论依据。本研究分为以下三个部分：第一部分人食管鳞癌组织、癌旁不典型增生组织及正常食管黏膜中VEGF-C及其受体VEGFR-3表达的研究方法1、采用免疫组化SP（Streptavidin-Peroxidase）法检测49例高发区食管鳞癌组织、23例癌旁不典型增生组织及49例正常黏膜中VEGF-C和VEGFR-3蛋白的表达。2、采用ISH和RT-PCR技术对49例高发区食管鳞癌组织、23例癌旁不典型增生组织及49例正常黏膜中VEGF-C和VEGFR-3 mRNA表达情况进行检测。3、采用免疫组化和双重酶组织化学技术对食管癌组织及癌旁组织中的淋巴管密度进行检测。4、统计学处理：所有数据均经SPSS 10.0软件进行统计分析。计数资料计算阳性率，计量资料用采用（?）±s表示；阳性率之间的比较采用χ²（chi-square）及Fisher确定概率计算法；等级相关资料采用秩和检验；两组均数的比较用t检验（t-test）；两组以上均数的比较用方差分析（ANVOA）。检验水准α=0.05。结果1、免疫组化结果显示：VEGF-C和VEGFR-3蛋白阳性信号定位于细胞质内。VEGF-C在正常食管黏膜、癌旁不典型增生组织阴性表达，在食管鳞癌组织中有表达，表达率为73.5％（36／49），其阳性表达与患者年龄、性别和癌组织病理学分级无关（P＞0.05），与淋巴结转移相关（P＜0.05），经处理有统计学意义。VEGFR-3在食管鳞癌组织中有表达，其表达率为32.7％（16／49），阳性表达与患者性别和癌组织病理学分级无关（P＞0.05），与淋巴结转移相关（P＜0.01），经处理有统计学意义。这一结果表明在食管鳞癌组织VEGF-C和VEGFR-3蛋白的表达与淋巴道转移有关。食管鳞癌组织中VEGF-C和VEGFR-3蛋白可同时在肿瘤细胞内表达，二者之间有联系（P＜0.05），并具有相关性。2、ISH检测VEGF-C mRNA结果显示：VEGF-C在正常食管黏膜不表达，在食管鳞癌组织中的表达率为46.9％（23／49），其阳性表达与性别和癌组织病理学分级无关（P＞0.05），与淋巴结转移相关（P＜0.01），经处理有统计学意义。VEGFR-3 mRNA在食管鳞癌组织中有表达，其表达率为24.5％（12／49），阳性表达与患者性别和癌组织病理学分级无关（P＞0.05），与淋巴结转移相关（P＜0.01），经处理有统计学意义。这一结果表明在食管鳞癌组织VEGF-C和VEGFR-3 mRNA的表达与淋巴道转移有关。3、RT-PCR扩增及电泳分析结果表明，在正常食管上皮组织中无VEGF-C mRNA表达，鳞癌组织有59.2％（29／49）表达率，其阳性表达与患者性别和癌组织病理学分级无关（P＞0.05），与淋巴结转移相关（P＜0.01），经处理有统计学意义。癌旁不典型增生黏膜组织中也有52.2％（12／23）的VEGF-C mRNA表达率，但其相对光密度ROD值0.31±0.18低于鳞癌组织中ROD值0.68±0.24，经统计学处理，差异有显著性（P＜0.01）。食管鳞癌中VEGF-C mRNA在RT-PCR和ISH两种方法的表达结果有联系（P＜0.01），两种方法的检出率差异无显著性（P＞0.05）。正常食管上皮组织中无VEGFR-3 mRNA表达，鳞癌组织有28.6％（14／49）表达率，其阳性表达与患者性别和癌组织病理学分级无关（P＞0.05），与淋巴结转移相关（P＜0.01），经处理有统计学意义。癌旁组织中有VEGFR-3 mRNA表达，表达率为52.2％（22／49），其阳性表达与淋巴结转移相关（P＜0.05）。4、酶组织化学检测结果表明，在49例食管鳞癌组织及其癌旁组织中的免疫组化淋巴管密度（lymphatic vessel density by IHC，LVDi）和酶组化LVD（LVD byenzyme-histochemical，LVDe），癌组织中LVDe和癌旁组织中LVDi和LVDe在有、无淋巴结转移时差异均有统计学意义（P＜0.01），有淋巴结转移癌绀中LVDi低于LVDe，差异有统计学意义（P＜0.01），癌旁组织中总LVD高于癌组织中总LVD，差异有统计学意义（P＜0.01）。第二部分RNA干扰对食管癌EC9706细胞中VEGF-C蛋白和mRNA体外表达的影响研究方法1、设计合成针对VEGF-C基因的编码短发夹RNA序列的DNA单链（HX1、HX2和HX3）及与人所有基因都不同源的对照寡核苷酸（HX4），构建真核表达载体pSINsi-U6-HX1、pSINsi-U6-HX2、pSINsi-U6-HX3和pSINsi-U6-HX4。2、将表达载体pSINsi-U6-HX1、pSINsi-U6-HX2、pSINsi-U6-HX3和pSINsi-U6-HX4及控制组空质粒分别转染人食管癌EC9706细胞。3、采用MTT实验、流式细胞技术及Boyden chamber侵袭实验检测筛选后阳性转染的细胞增殖、周期和细胞侵袭能力的变化。4、采用免疫组化、原位杂交和RT-PCR方法检测转染后食管癌EC9706细胞VEGF-C蛋白及mRNA的表达。5、统计学处理：应用SPSS 10.0统计软件进行统计学处理，计数资料计算阳性率，计量资料用采用（?）±s表示；阳性率之间的比较采用χ²及Fisher确定概率计算法；等级相关资料采用秩和检验；两组均数的比较用t检验；两组以上均数的比较用方差分析（ANVOA）。检验水准α=0.05。结果1、各组转染细胞经G418筛选，得到稳定pSINsi-U6-HX1、pSINsi-U6-HX2、pSINsi-U6-HX3和无关序列pSINsi-U6-HX4阳性细胞转染克隆。2、MTT结果表明，转染pSINsi-U6-siRNA质粒的食管癌EC9706、转染无关序列组细胞和正常对照组细胞，5组结果经统计学处理，差异无显著性（P＞0.05），提示VEGF-C RNAi转染对细胞增殖无明显影响。3、检测转染前后的EC9706细胞周期变化，转染pSINsi-U6 RNAi质粒组、转染无关序列组和正常对照组细胞G₀／G₁期和S期结果分别为：pSINsi-U6-HX1 pSINsi-U6-HX2 pSINsi-U6-HX3 pSINsi-U6-HX4 EC9706G0／G1期78.3±6.5％84.9±7.1％77.6+6.9％，79.2±7.2％79.4±7.4％S期12.9±1.2％12.5±1.0％12.8±1.1％13.3±1.2％13.5±1.3％各期结果分别比较，仅在发现转染HX2组中处于G₀／G₁期细胞比例增多、S期细胞比例减少，与正常EC9706对照组相比较，差异有显著性（P＜0.05），而其他各组、各期细胞和G2／M期与正常EC9706组相比，差异无统计学意义，结果表明转染VEGF-CsiRNA可能对细胞周期无明显影响。4、Boyden chamber实验检测转染前后EC9706细胞的侵袭穿膜能力，4个转染组分别与正常细胞组细胞穿膜数比较，差异无显著性意义（P＞0.05），表明转染VEGF-CRNAi对EC9706细胞的侵袭能力无明显影响。5、免疫组化结果显示，转染pSINsi-U6 RNAi质粒的食管癌EC9706细胞VEGF-C蛋白表达率低于正常对照组细胞和无关序列质粒转染组细胞的表达率，提示VEGF-CRNAi可抑制EC9706细胞VEGF-C蛋白表达。6、原位杂交结果表明，转染pSINsi-U6 RNAi质粒的食管癌EC9706细胞VEGF-CmRNA表达率低于转染无关序列组细胞和正常对照组细胞的表达率，提示VEGF-CRNAi可抑制VEGF-C mRNA表达。7、提取各组细胞总RNA，经RT-PCR及电泳分析，各组电泳条带均有229bp特异性VEGF-C基因阳性条带和480bp内参照β-actin条带，但正常EC9706细胞组和无关序列组均在二者之比即相对光密度值（ROD）分别为（0.71±0.14）和（0.69±0.18），差异无显著性；而转染组有较弱的VEGF-C特异性条带和内参照β-actin条带，二者相对光密度值之比分别为（0.35±0.03）、（0.34±0.02）和（0.34±0.03），组内差异无显著性，而低于正常组和无关序列组，差异均有统计学意义（P＜0.01），表明VEGF-CRNAi转染，可抑制VEGF-C mRNA表达。第三部分RNA干扰对食管癌EC9706细胞在裸鼠食管癌移植瘤中VEGF-C蛋白和mRNA体内表达的影响研究方法1、SPF环境饲养裸小鼠，将正常食管癌EC9706细胞及转染VEGF-C siRNA后的各组细胞分别注射入实验裸鼠腹侧腋窝皮下，构建裸鼠移植瘤模型。2、观察各组裸鼠的生长情况以及移植瘤的重量和体积。3、采用免疫组化、原位杂交和RT-PCR技术，观察各组移植瘤组织中VEGF-C蛋白和mRNA表达。4、统计学处理：所有数据均经SPSS 10.0统计软件进行统计学处理，计数资料计算阳性率，计量资料用采用（?）±s表示；阳性率之间的比较采用χ²及Fisher确定概率计算法；等级相关资料采用秩和检验；两组均数的比较用t检验；两组以上均数的比较用方差分析（ANVOA）。检验水准α=0.05。结果1、各组裸鼠均长出瘤体，处死动物后，分离肿瘤、称重并测量体积，做进一步检测。结果表明，肿瘤组织呈实性，与周围组织界限清，未见有腹水和体内其它脏器的转移灶。2、转染各组和正常对照组、无关序列转染组移植瘤质量依次为：863±90mg、784±73mg、875±93mg和912±97mg、8901±95mg，移植瘤体积依次为：528±44mm³、483±33mm³、513±42mm³和582±59mm³、561±57mm³，除HX2转染组肿瘤体积与正常对照组差异有非常显著性（P＜0.01）、与无关序列转染组间差异有显著性（P＜0.05），以及重量与正常对照组差异有显著性（P＜0.05）外，其它各组间差异均无统计学意义。3、免疫组化结果显示，转染组VEGF-C蛋白表达明显低于正常对照组（P＜0.01），也低于无关序列转染组（P＜0.05，P＜0.01），经统计学处理，差异有显著性意义；而无关序列转染组与正常对照组之间VEGF-C蛋白表达差异无统计学意义。结果表明，针对VEGF-C转染的siRNA可抑制食管癌EC9706细胞移植瘤VEGF-C的蛋白表达。4、原位杂交（ISH）和RT-PCR检测显示，转染组VEGF-C mRNA表达明显低于正常对照组和无关序列转染组（P＜0.01），经统计学处理，差异有显著性；而无关序列转染组与正常对照组之间VEGF-C mRNA表达差异无显著性。结果表明，针对VEGF-C转染的siRNA可抑制食管癌EC9706细胞移植瘤VEGF-C mRNA的表达。结论1、检测食管癌高发区食管鳞癌组织中VEGF-C和VEGFR-3在蛋白水平及mRNA水平均呈高表达，其表达与淋巴结转移有相关性，并且该二种基因表达具有相关性，为食管癌抗淋巴管生成治疗提供了新靶点。2、联合应用免疫组化和酶组织化学技术（5’-核苷酸酶-碱性磷酸酶双重染色法）检测食管癌组织及癌旁间质组织中淋巴管密度，证明了食管癌组织中有新生淋巴管形成，且癌周淋巴管密度高于癌组织，并与淋巴结转移有关。3、首次应用RNAi技术，构建了3个针对VEGF-C特异性pSINsi-U6 siRNA真核表达载体，并转染人食管癌EC9706细胞，经药物筛选获得稳定阳性克隆。经RT-PCR、原位杂交和免疫组化技术证实在mRNA和蛋白水平VEGF-C表达显著下降，VEGF-CRNAi可抑制VEGF-C基因的体外表达。4、将转染了pSINsi-U6 siRNA的食管癌EC9706细胞移植入裸鼠皮下，形成移植瘤，并观察瘤体的生长特点，经免疫组化、RT-PCR和原位杂交技术证实，移植瘤组织中VEGF-C在mRNA和蛋白水平表达显著下降，VEGF-C RNAi可抑制VEGF-C基因体内的表达。5、体内、外实验发现，转染HX2组细胞和移植瘤组织中VEGF-C不仅在mRNA和蛋白水平表达显著下降，而且在细胞周期、移植瘤体重量和体积等指标均有抑制，可能为筛选出特异性VEGF-C siRNA抑制片段提供有益的尝试。