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拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国南部沿海重要经济养殖品种,由于缺乏拟穴青蟹的相关免疫知识,迄今无法真正实现拟穴青蟹的健康养殖。抗菌肽类的免疫因子在海洋动物的先天性免疫中具有重要作用,因此挖掘新的抗菌肽对揭示拟穴青蟹的免疫机制具有重要的科学意义。组蛋白Histone是真核生物染色体的基本结构蛋白,一些研究证明组蛋白的成分具有抗菌活性。本实验室在前期研究中,从LPS刺激的拟穴青蟹血细胞SSH cDNA文库中筛选到一个类似Histone2A的基因,推测其可能在拟穴青蟹体内具有抗菌等免疫功能,因而对其进行了细致的研究工作,取得了以下研究成果。
⑴阐明了拟穴青蟹Histone2A的cDNA全长序列。拟穴青蟹Histone2AcDNA序列(GeneBank登录号为FJ774663)全长1096 bp,包含一个384 bp的开放阅读框,编码128个氨基酸,其理论分子量为13463.6 Da,等电点为10.58。
⑵合成肽Histone2A具有显著的抗菌活性,命名为Sphistin。利用生物信息学分析了拟穴青蟹Histone2A基因序列和氨基酸序列特征,通过化学合成方法合成了拟穴青蟹Histone2A N端前38个氨基酸。采用液体倍比稀释法测定了Histone2A合成肽对8种革兰氏阳性菌、13种革兰氏阴性菌、2种酵母菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果显示Histone2A合成肽对重要的水产致病菌嗜水气单胞菌等7种革兰氏阴性菌、人畜致病菌金黄葡萄球菌、表皮葡萄球菌等4种革兰氏阳性菌均有抑菌作用和杀菌作用,大部分MIC浓度小于6μM,对毕赤酵母菌同样有抑杀作用。结果表明Histone2A基因的合成肽具有生物活性,将其命名为Sphistin。用Sphistin对金黄葡萄球菌、大肠杆菌MC1061和谷氨酸棒杆菌的杀菌动力学曲线研究表明,1.5μM Sphistin可在2 h杀灭90％以上的谷氨酸棒杆菌；3μM Sphistin可在10 min杀灭90％以上的金黄色葡萄球菌;25μM Sphistin在3h可以杀灭90％以上的大肠杆菌MC1061。
⑶Sphistin对肿瘤细胞具有抑制作用。使用鼠正常成骨细胞MC3T3-E1和人肝癌细胞HepG2检测Sphistin对细胞的毒性程度。将0-100μg/mL Sphistin分别与两种细胞共孵24h,在显微镜下观察细胞形态,并应用MTT法检测细胞相对活力。结果表明0-100μg/mL浓度范围内的Sphistin对鼠正常成骨细胞MC3T3-E1没有明显的细胞毒性；而不同浓度的Sphistin对人肝癌细胞HepG2均表现出抑制细胞活力的作用。将100μg/mL Sphistin与HepG2细胞共孵24 h后,细胞相对活力降低了20％。细胞形态观察和MTT检测细胞活性结果表明,Sphistin对正常细胞无明显细胞毒性,而对癌细胞有抑制作用。
⑷Sphistin具有破坏细菌细胞膜的能力。大肠杆菌MC1061工程菌质粒经改造后在细菌内部表达荧光素酶,使用大肠杆菌MC1061检测Sphistin与细胞膜作用的情况。大肠杆菌MC1061与高浓度(25μM和50μM)的Sphistin作用后,荧光发光量显著高于阴性对照蛋白组(六胜肽),表明其迅速破坏了细菌的细胞外膜结构,使细菌死亡。而大肠杆菌MC1061与较低浓度(12.5μM)Sphistin的作用后,荧光检测结果表明低浓度的Sphistin仅是抑制了细菌的繁殖却并未杀死细菌。高浓度和低浓度的Sphistin与大肠杆菌MC1061作用结果证明了Sphistin是一种破坏细胞膜结构的蛋白,可以增强细菌细胞膜的通透性和破坏细菌细胞膜的结构。
⑸获得了拟穴青蟹Histone2A的基因表达产物。利用pET-32a+、pET-28a+和pBV220构建了三个Histone2A基因的原核表达载体,其中pET-32a+和pBV220载体在大肠杆菌中诱导表达了Histone2A目的蛋白,带有Trx·tag标签的pET32a表达产物分子量30 kDa,含有283个氨基酸,等电点为9.3,为上清表达；pBV220原核载体表达产物与预期的目的蛋白分子量一致,经SDS—PAGE验证为16 kDa左右,由128个氨基酸组成,等电点为10.58,以包涵体形式表达。拟穴青蟹Histone2A的原核表达为将来应用建立了技术支撑。