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背景在孵育抗体前检验转膜效率以及蛋白等量上样是western blot成功的关键。总蛋白染色法常常用来检验转膜效率和上样标准化,该法在western blot中扮演重要角色。常用的总蛋白染色法如立春红染色、考马斯亮蓝染色近年来却被报道有各种各样的缺陷,因此,我们尝试着能否设计出一种经济、简便、快速的检验转膜效率及上样标准的方法。众所周知,当甲醇从PVDF膜上挥发,膜上蛋白结合区域仍然保持亲水性,但是膜上非蛋白结合区域却再次变回PVDF膜的疏水特性。似乎可以根据PVDF膜润湿性的变化规律设计出检测转膜效率和上样标准化的optical方法。另一方面,western blotting有许多步骤,每一步都会造成误差干扰最后的结果。为了让最后的结果更准确,我们通常需要确保蛋白样本的等量上样。然而,近年来有文献报道管家基因蛋白,例如GAPDH、β-actin等,它们在细胞或组织某些条件或疾病状态下其表达量并不总是恒定。那么,在各种疾病状态下的肝脏组织中,管家基因蛋白表达是否保持恒定仍不清楚。目的1.本研究旨在设计一个optical方法让实验者不用染色即可在几分钟内观察到转膜后PVDF膜上的蛋白泳道。2.本研究的另一目的即是探索人肝细胞性肝癌组织中与小鼠脂肪肝组织中管家基因蛋白作为上样内参的可靠性。方法1.用western blot检验所设计的optical方法的可靠性与可重复性。2.用等量上样的western blot检测人肝细胞性肝癌组织与癌旁组织中GAPDH,β-actin和β-tubulin的表达情况。3.用梯度蛋白上样法去检测人肝细胞性肝癌组织与癌旁组织中GAPDH,β-actin和β-tubulin条带灰度值与蛋白上样量的线性关系。4.用等量上样的western blot检测小鼠脂肪肝组织与小鼠正常肝组织中GAPDH,β-actin和β-tubulin的表达情况。5.用梯度上样法检测小鼠脂肪肝组织与小鼠正常肝组织中GAPDH,β-actin和β-tubulin条带灰度值与western blot上样量的线性关系。结果1.我们可以根据PVDF膜蛋白结合区域与非蛋白结合区域不同的润湿性去检测转膜效率及上样的标准化,并且该optical方法不会影响western blot的后续实验。2.和癌旁组织相比,人肝细胞性肝癌中β-actin表达水平显著增高(P<0.05);人肝细胞性肝癌中β-tubulin的表达水平明显高于癌旁组织(P<0.05);而GAPDH在癌组织与癌旁组织之间表达水平无明显差异(P>0.05)。3.GAPDH、β-actin和β-tubulin与蛋白上样量均有较好的线性关系。4.和小鼠正常肝组织相比,小鼠脂肪肝β-actin表达水平显著降低(P<0.05);小鼠脂肪肝中β-tubulin的表达水平明显高于小鼠正常肝组织(P<0.05);而GAPDH在小鼠脂肪肝与正常肝之间表达水平无明显差异(P>0.05)。5.在小鼠正常肝组织和脂肪肝组织中,GAPDH与上样量的线性关系强于β-actin;而GAPDH和β-tubulin与上样量均具有较好的线性关系。结论1.可以根据PVDF膜润湿性的变化原理设计Qualitative optical方法,该法可在孵育一抗前检测western blotting的转膜效率和蛋白上样的标准化。2.在人肝细胞性肝癌组织和癌旁组织以及C57小鼠肝组织与其脂肪肝组织中,GAPDH作为WB内参比β-tubulin和β-actin更可靠。