论文部分内容阅读
研究背景目的:
自限性疾病是指可以自然康复的疾病。本文通过不同浓度D-葡萄糖处理小鼠间充质干细胞(Mouse mesenchymal stem cells，MSCs)系中的C3H10T1/2细胞，建立体外C3H10T1/2自限性康复模型(Self-limited recovery of C3H10T1/2mesenchymal stem cells，SRCMs)和自限性康复功能失调模型(DysfuntionalSelf-limited recovery of C3H10T1/2 mesenchymal stem cells，DSRCMs)，采用不同剂量红光(640 nm±15 n)(Red light at640 nm±15 nm from light emitting diodearray, RLED)处理DSRCMs。旨在为自限性这一现象提供实验依据，探讨RLED的光生物调节作用(photobiomodulation，PBM)，并以刘承宜等人提出的功能内稳态(function-specific homeostasis，FSH)概念对自限性现象及机制加以阐释。
研究方法:
用无糖(deprivation glucose，dG)(0 mM)、低糖(low glucose，1G)、(5 mM)和不同浓度的高糖[high glucose，hG)(100 mM(hGl)，200 mM(hG2)，300 mM(hG3)]培养C3H10T1/2，分别在不同时间点(3 h、6h、12h、24 h、48 h、72 h、96 h)撤除dG、1G和hG增殖培养基，换正糖(normal Glucose，nG)(22.5 mM)增殖培养基一直培养。噻唑蓝(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium brom-ideassay, MTT)及细胞计数试剂盒8(Cell Counting Kit-8，CCK8)在第48 h、96 h、144 h、192 h进行细胞增殖活性检测。建立体外C3H10T1/2的SRCMs和DSRCMs。
对于DSRCMs，不同剂量RLED(0.17，0.35，0.71，1.41，2.68，5.03,9.51,15.41 mW/cm2，简称(R17，R35，R71，R141，R268，R503，R951，R1541)处理，处理方案为每日照射一次，每次15 min。MTT法及CCK8法在第48 h、96 h、144 h、192 h进行细胞增殖活性检测。根据MTT及CCK8结果，选取最佳剂量RLED处理DSRCMs，在第48 h、96 h、144 h、192 h、采用酶循环比色法检测不同时间点胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)和其还原形式(reduced form of NAD+，NADH)的比值，实时聚合酶链式反应(real-time reversetranscription polymerase chain reaction，RT-PCR)检测NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶(sirtuin1，SIRTl)及胰岛素类生长该因子1(Insulin-like growth factor-1，IGF-1)等基因信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)表达水平。
研究结果:
1、细胞3-96 h的dG和1G应激在192 h增殖活性可以自限性康复;3-72 h的hG1应激，在第96 h后增殖活性可以自限性康复;3-72 h的hG2应激，在第192 h，除72 h组外的各hG2撤除组增殖活性均可以自限性康复;3-24 h的hG3应激，在第192 h，3h、6h组细胞增殖活性可以自限性康复，其它时间点均不可自限性康复。将hG2应激72 h撤除组(high glucose removal of200 mM for72h，HR2)和hG3应激12h撤除组(high glucose removal of300 mM for12 hours，HR3)作为DSRCMs。
2、在第48 h和96 h，RLED对HR2和HR3细胞增殖活性均不起调节作用。第144 h后，R35、R71、R141、R268和R503可以让HR2状态下的细胞增殖功能调节到nG水平。
3、(1)在第48和96 h，hG2、HR2、hG3和HR3分别上调细胞NAD+/NADH(P＜0.01)，RLED照射下调细胞NAD+/NADH(P＜0.01)，在第144和192 h，hG2、HR2、hG3、HR3下调细胞NAD+/NADH(P＜0.01)，RLED照射上调细胞NAD+/NADH(P＜0.01);(2)DSRCM中HR2实验结果显示:(2)与nG相比较:在第48 h，R503下调SIRT1的mRNA表达水平(P＜0.01)(不)别对IGF-1的mRNA表达水平无影响(P＞0.05)。在第96 h，R141和R503分别上调SIRT1的mRNA表达水平(P＜0.05)，R141下调IGF-1的mRNA表达水平((P＜0.01)。在第144和192 h，R141和R503分别与nG的SIRT1的mRNA和IGF-1的mRNA表达水平无显著性差异(P＞0.05)。(3) DSRCM中HR3实验结果显示，与nG相比较:在第48 h，R141和R503分别下调SIRT1的mRNA表达水平(P＜0.01，P＜0.05)，对IGF-1的mRNA表达无影响(P＞0.05);在第96 h，R141和R503分别上调SIRT1的mRNA表达水平(P＜0.01)，对IGF-1的mRNA表达无影响(P＞0.05);在第144 h，R141和R503分别与nG的SIRT1的mRNA表达水平无显著差异(P＞0.05)，R141下调IGF-1的mRNA表达水平(P＜0.01);在第192 h，R141和R503分别与nG的SIRT1和IGF-1的mRNA表达水平无显著性差异(P＞0.05)。
研究结论:
nG维持C3H10T1/2细胞增殖内稳态(proliferation-specific homeostasis，PISH)，dG、1G或hG打破PISH，C3H10T1/2细胞耐受dG和1G应激能力高于hG应激;对于一定时间的dG，1G或hG应激，C3H10T1/2细胞增殖能力可以自限性康复;hG应激强度增加（时间延长和糖浓度加大）使细胞出现DSRCMs，RLED能够促进DSRCMs康复，实现成功应激，其机制受NAD+/SIRT1和IGF-1所介导。