目的资料显示，在男性不育中，约10%的患者为无精子症，却能产生正常的变态前的圆形精子细胞。第1例人ROSI技术获得的妊娠由Tesarik等于1995年报道，他们将从无精子症病人精液中获得的ROS注入卵子后出生了2位正常婴儿。虽然ROSI的成功为NOA患者带来了希望，但是ROSI的成功率很低，并且ROSI后胚胎的染色体非整倍性增加，准确的挑选出正常的单倍体精子细胞是该技术的一个巨大挑战。然而，鉴别活的单倍体精子细胞不是一个容易的过程，本实验为了建立稳定的精子细胞Puresperm非连续梯度离心和FISH（荧光原位杂交）检测技术，得到密度较高的单倍体圆形精子细胞，并对挑选出的精子细胞作倍性验证分析，初步了解单倍体圆形精子细胞的基本形态特征，为今后准确识别单倍体精子细胞提高准确率，为确切诊断NOA患者提供依据，为科学研究提供识别单倍体圆形精子细胞的方法。方法睾丸活检标本来自安徽医科大学某医院无精子症患者睾丸活检组织，根据病理检查报告为非梗阻性无精子症，收集非梗阻性无精子症患者13例。然后对13例患者睾丸组织经过细胞涂片，利用FISH技术初步筛选出含有单倍体精子细胞的睾丸组织进行下一步实验，并在荧光显微镜下测量单倍体精子细胞的直径，并记录。实验进行前已告知患者取得其知情同意。将睾丸组织经过眼科小剪和TB针头撕碎后，经过酶消化、离心等处理，制备成单细胞悬液，再经过Puresperm非连续梯度离心，将含有单倍体精子细胞较多的分层单细胞悬液收集，最后在倒置显微镜下利用激光镜头（可以测量细胞直径）分别挑选出直径5μm、6μm，7μm，8μm精子细胞，每组细胞30枚，然后采用FISH（荧光原位杂交）技术进行杂交，检测每组单倍体精子细胞所占总数的比例。结果①13例非梗阻性无精子症患者对其睾丸组织经过处理制备成单细胞悬液进行细胞涂片后，经过FISH检测发现其中6例存在单倍体精子细胞，并初步在荧光倒置显微镜下测量细胞直径，X单倍体精子细胞平均直径在5.5μm，Y单倍体精子细胞平均直径在5.3μm。二倍体XX精子细胞平均直径为8.5μm，二倍体YY精子细胞平均直径为8μm。②Puresperm非连续梯度离心处理得到结果：70%分离层中圆形精子细胞的数量最多，而70%、70%与50%、50%层细胞较少。通过倒置显微镜下观察发现，在70%和100%交界面处各级生精细胞均有存在，但与未离心处理后单细胞悬液对比发现，离心后的细胞相对均匀，尽管未能排除其他的各级生精细胞。③单倍体圆形精子细胞的挑选在400×Hoffman倒置显微镜下，利用激光镜头测量细胞直径，选择出的圆形精子细胞基于细胞的外形、细胞直径、细胞核特征、顶体帽的出现、细胞质的特征，圆形精子细胞直径在5-7μm，细胞核直径在4-6μm，细胞核质比例较固定，细胞圆形，细胞表面光滑，细胞质较亮，细胞核较均匀，在圆形精子细胞较早阶段细胞核多位于细胞的中心位置，较后阶段，细胞核较多位于细胞的边缘。顶体泡/帽结构偶尔被观察到，与细胞核毗连，位于细胞的的边缘，顶体泡/帽较小，成灰色的点状结构，在倒置显微镜下观察与精子的顶体帽结构颜色像似。细胞质围绕细胞核类似薄的环状结构。圆形精子细胞的区分依靠细胞的大小，与圆形精子细胞区分较为困难的是次级精母细胞，因为它们的细胞形态学特征极其像似，通常次级精母细胞直径稍大一点，但是次级精母细胞通常也很少被观测到在射出的精液中和睾丸组织中，因为与存在两周以上的初级精母细胞相比较而言，他们存在的过程较短，不足24小时，（1976Burger），圆形精子细胞与其他直径较大的血细胞相比较容易区分。淋巴细胞直径在7-12μm，但是他们的细胞核较大，而且淋巴细胞核成圆形或者锯齿状结构，细胞质较窄不是连续的包围着细胞核。④使用双色FISH杂交，每组细胞均获得清晰的荧光信号，绿色代表X号染色体，橙色代表Y号染色体。在5-8μm范围内，直径越小的细胞，为单倍体精子细胞的可能性越大，挑选的准确率较高。结论Puresperm非连续梯度离心和FISH技术对于评估非梗阻性无精子症患者睾丸组织内有没有单倍体圆形精子细胞是一种比较有用的一种方法，二者结合能够确定单倍体精子细胞的基本特征，能够指导临床医生准确的识别单倍体精子细胞，并可以起到质量控制的重要作用，同时FISH技术也可以检测圆形精子细胞染色体的组成。