在骨髓基质中存在非造血细胞称为骨髓间充质干细胞或祖细胞。这种细胞在体内外均能增殖和诱导分化成其他组织细胞,如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌健、平滑肌细胞、神经细胞和造血间质细胞等。这些细胞具有多向分化潜能、自我更新、高度增殖能力、易获得、自体损伤小、免疫原性弱、自体移植不发生排斥反应等特点,越来越受到医学研究者的青睐。目前在分子和细胞水平有大量的有效数据证明骨髓间充质干细胞可以应用于细胞替代治疗、组织器官移植和基因治疗等,是一种良好的替代治疗的靶细胞,具有广泛的临床应用前景。但是骨髓中骨髓间充质干细胞含量极少,只占整个骨髓中有核细胞的十万分之一,并随年龄增加而减少,同时骨髓还含有其他多种细胞成分,因此如何获取体外分离、纯化和扩增较高纯度和数量的骨髓间充质干细胞是目前亟待解决的问题。本文主要通过体外培养观察不同微环境下骨髓间充质干细胞的生长增值状态及纯度,寻找比较适合骨髓间充质干细胞体外生长的微环境,对其进行体外标记,为以后进行活体内移植标记追踪打下实验基础。目的观察四种不同血清微环境对大鼠骨髓间充质干细胞体外生长的影响。改良体外培养BMSCs的培养条件。用Hoechst33342标记法标记细胞观察骨髓间充质干细胞细胞,寻找合适的体外标记方法,为MSCs进行活体体内移植标记追踪打下基础。方法选取6-8周龄SD雄性大鼠,从大鼠股骨、胫骨中提取细胞,采用全骨髓贴壁法培养。体外分为四种培养方式：第一组(自身血清组)：原代细胞用含10%自身血清培养液培养,开始传代后换用含10%胎牛血清培养液培养；第二组(同种异体血清组)：原代细胞用含10%同种异体血清培养液培养,传代后用含10%胎牛血清培养液培养。第三组(胎牛血清组)：原代和传代后的细胞均采用含10%胎牛血清的培养液培养；第四组(无血清组)：原代细胞用基础培养液培养,传代后用含10%胎牛血清培养液培养。倒置显微镜下观察细胞形态,增殖情况,流式细胞仪检测细胞表面分子CD34和CD44的阳性表达率,Hoechst33342标记法标记观察细胞的标记率,及荧光持续时间及标记对细胞增殖的影响。结果1.显微镜下观察大鼠自身血清微环境下培养的细胞形态均一,呈长梭形,集落式或旋涡状生长,数量较多,第二组细胞形态与第一组相似,都具有高的纯合度和较短的首次传代时间。基础培养液培养下的细胞较稀少,只有稍许集落式生长。2.生长曲线图体现出自身血清组细胞倍增速度快于同种异体血清组和胎牛血清组,无血清组细胞生长缓慢无明显倍增速率。3.流式细胞仪检测细胞表面标志物结果显示：前三组细胞CD44阳性表达率较高,均在95%以上,而无血清培养条件下CD44阳性表达率在65.79%。这说明含血清的培养基培养的细胞纯度比不含血清组高4.大鼠MSCs经Hoechst33342标记后细胞核都在紫外光激发下显示亮蓝色,Hoechst33342的标记率几乎达到100%。标记上Hoechst33342的大鼠骨髓MSCs仍然可以继续增值生长,随着分裂代数的增多,荧光强度逐渐变弱。4周后仍可见淡淡的荧光。结论自身血清组培养的细胞具有形态均一性好、纯合度高、首次传代时间短、倍增速率快等优点。以上实验结果提示大鼠自身血清微环境培养条件下更有利于骨髓间充质干细胞的贴壁、增值及纯化。用Hoechst33342体外标记BMSCs效果好,标记率高且对细胞生长增值无明显影响,提示Hoechst可作为体外BMSCs研究的标记物,为MSCs进行活体体内移植标记追踪打下基础。