流感病毒能引起人类和动物急性呼吸道传染病,其传染性强,传播速度快,容易引起在世界范围内的广泛流行,是严重危害人类健康及社会安全的重要病原体之一。流感病毒可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型,其中甲型流感病毒的抗原性较易发生变异,是多次世界性的流感大流行的主要致病型别,导致大量人员死亡,造成巨大经济损失。目前预防流感的主要手段是接种疫苗,传统流感疫苗主要以鸡胚为生产基质,由于其生产工艺繁杂,生产成本高,在储备不足或致病亚型突变的情况下,很难应对流感大流行爆发。在传统的流感疫苗中加入佐剂能增强抗原的免疫原性,显著降低疫苗的抗原用量,既节约疫苗生产成本,又能有效应对流感爆发。纳米乳是一类由表面活性剂、助表面活性剂、油相、水相按一定比例混合形成的透明、澄清、稳定的运载系统。纳米乳作为载药系统已有大量研究,但作为疫苗佐剂则研究的较少。现已有AF03等乳佐剂被批准用于人体,以应对传染性疾病的爆发,AFO3是目前唯一被批准用于人体的纳米乳佐剂。在本实验室已有配方的基础上,改良配方后形成新的纳米乳系统。通过对载水量、乳化剂、油相的优化,获得了安全、稳定、有效的最适配方,另一方面通过对不同粒径大小、颗粒密度、载苗方式的佐剂效果比较,探究影响佐剂效果的直接因素。第一部分纳米乳载水量的优化在实验室已有配方的基础上,进行Km值和乳化剂+助乳化剂与油相质量比的初步优化,筛选出透明稳定,能被水无限稀释的配方A (Tween80, Span80,：1,2-丙二醇：7#白油)及配方D (Tween20, Span80,：1,2-丙二醇：7#白油)。在此基础上,将其配制成载水66.7%、80%、85.7%的纳米乳,测其性质后进行动物实验,检测HI抗体,筛选出佐剂效果好的纳米乳,进行IgG、IgG1、IgG2a、IL-4、IFN-γ水平检测。不同载水量的纳米乳佐剂效果不同,载水80%和85.7%的纳米乳佐剂效果较好。原因可能在于,纳米颗粒稳定形成后,水主要起稀释作用,不同的载水量主要影响纳米颗粒的密度从而产生不同的佐剂效果,对于特定的纳米乳配方应该存在一个最适载水量,将已形成的纳米乳颗粒稀释到合适的程度从而达到佐剂效果最佳。本实验结合安全性及有效性考虑,选择85.7%的载水量作为最适载水量进行后续实验。第二部分载苗方式优化载苗方式主要是比较吸附方式(方式二)和包裹方式(方式四)激发免疫反应的强度不同,吸附方式是先加水形成稳定的纳米乳颗粒,最后加入的抗原将存在于水相中吸附于纳米颗粒表面,而包裹方式则是先加入疫苗液形成纳米乳颗粒包裹抗原的形式,最后加入再加适量的水,将其稀释进行动物实验。结果吸附方式表现出强的佐剂效果,而包裹方式则不及吸附方式载苗的免疫反应水平,甚至完全不表现出佐剂效果,其机理有待进一步研究。第三部分纳米乳乳化剂及油相的优化研究表明,乳化剂和油相种类及比例对于纳米乳颗粒大小,颗粒密度有重大影响。本实验的乳化剂采用复合成分,固定Span80的量,比较Tween20, Tween80, EL三者成乳后的性质及佐剂效果；油相的优化是在固定乳化剂与助乳化剂用量的基础上,形成载水85.7%的纳米乳,比较白油,IPM,大豆油,葡萄籽油成乳后性质的不同及动物实验中佐剂效果的差异。结果表明,Tween20或Tween80成乳后佐剂效果更好,白油及IPM成乳后也表现出较好的佐剂效果。粒径较小的配方佐剂效果明显,而粒径大于100nm的几种配方则无佐剂效果甚至产生免疫抑制作用。因此,粒径大小是影响佐剂效果的因素之一。综合考虑稳定性,均匀度,安全性及有效性,筛选出配方D:Tween80, Span80,:1,2-丙二醇：7#白油=1：1：2：1为最佳配方。