论文部分内容阅读
由严重急性呼吸道综合征冠状病毒2（SARS-Co V-2）引起的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）,自2019年12月首次发现,便在全球广泛传播,对社会产生巨大不良影响,严重威胁人类生命健康。由于COVID-19传播速度快、传染能力强、感染率高,危害性极大,对COVID-19感染者采取“检测-追踪-隔离”措施,对SARS-Co V-2进行更早更快诊断,可有效控制COVID-19的传播。实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-q PCR）是疫情期间SARS-Co V-2核酸检测的金标准。然而,RT-q PCR检测需要在专有的实验室由训练有素的专业技术人员借助高精密仪器才能完成,大量RT-q PCR检测给医疗系统及疫情防控带来巨大的负担和挑战。因此,在COVID-19全球大流行背景下,迫切需要开发快速、简单、低成本以及高灵敏的SARS-Co V-2核酸检测方法。本论文从核酸一体化检测角度出发,以硅基微珠提纯核酸,将核酸提纯扩增检测集成于一体,分别采用比色法LAMP、一步巢式PCR以及CRISPR检测技术,建立了三种高灵敏可视化的SARS-Co V-2核酸检测方法。具体研究内容如下。（1）一体化高灵敏核酸检测-取样的泊松分布分析。首先,从低浓度样本取样概率的角度入手,应用泊松分布分析了在核酸检测过程中不同取样体积下低浓度样本的取样概率。泊松分布计算表明,低浓度样本小体积取样取到零个靶标分子数的概率极大,且重复取样取到不同靶标分子数的概率差异很大;增加取样体积可显著降低取到零个靶标分子数的概率,且重复取样取到不同靶标分子数的概率差异变小。使用SARS-Co V-2假病毒样本以及临床RNA样本,借助高灵敏度的RT-q PCR核酸检测试剂盒比较了低浓度样本不同取样体积下的阳性检出率。对于Ct≥35的低浓度样本,取样体积由2μL增加至10μL,阳性检出率约提高了50%。采用核酸提取扩增一体化检测,对于浓度为0.3 copy/μL的SARS-Co V-2样本,初始取样体积由100μL增加至500μL,阳性检出率由40%增加至100%。在此基础上,我们提出:核酸免提取一体化检测不适用于低浓度（≤200copies/m L）样本的高灵敏诊断;增加取样体积和采用核酸提取扩增一体化检测可以显著提高核酸检测的灵敏度和稳定性。（2）基于硅羟基活化玻璃珠的LAMP一体化可视化核酸检测方法。以表面Si-OH活化的玻璃珠快速提纯病毒RNA,结合比色法LAMP技术,构建了一种简易快速的一体化可视化病毒RNA检测方法。此方法的特点是,玻璃珠提纯的病毒RNA无需洗脱,在同一反应管中可直接加入LAMP反应液启动扩增检测。我们使用一种与SARS-Co V-2核苷酸序列相似性高达85%的GX＿P2V冠状病毒优化该方法,包括病毒RNA提纯优化以及LAMP扩增检测优化。Si-OH玻璃珠在胍盐裂解液中可快速特异性结合病毒RNA,玻璃珠对LAMP扩增无抑制,全程检测在1小时之内即可完成,无需借助仪器,肉眼读取检测结果。基于活化玻璃珠的LAMP一体化可视化方法检测GX＿P2V细胞培养上清的检测限为4 copies/μL,检测GX＿P2V模拟临床样本的检测限为15 copies/μL。该方法检测SARS-Co V-2模拟假病毒样本的检测限为2.2 copies/μL;同时,20个SARS-Co V-2临床阴性样本的结果与q PCR 100%一致,与GX＿P2V和宿主细胞无交叉反应。上述研究初步建立了一种集核酸提取扩增检测于一体的快速灵敏的病原体检测方法,为SARS-Co V-2核酸快速检测提供了一个新的有应用前景的平台。（3）基于硅基磁珠的LAMP一体化可视化核酸检测方法。为进一步提高LAMP一体化可视化检测的灵敏度,以大比表面积的硅基磁珠提纯病原体核酸。该方法将病毒RNA提纯、扩增和检测集成于一个反应管内。硅基磁珠纯化病毒RNA后,无需RNA洗脱,可直接加入比色法LAMP扩增液启动反应。硅基磁珠不仅与LAMP反应完全兼容,而且可以在一定范围内增强LAMP扩增效率。基于硅基磁珠的LAMP一体化可视化检测全程所需时间小于1小时,针对SARS-Co V-2的检测限为200 copies/m L,可稳定检测SARS-Co V-2的各个VOC突变株,且该方法非常适合混样检测。29例临床样本评估表明,基于硅基磁珠的LAMP一体化可视化检测与当前的核酸检测金标准q PCR一致性达100%。基于硅基磁珠的LAMP一体化可视化检测方法,无需专业实验室无需专业技术人员无需专业设备支撑,符合POCT检测理念,在居家自检以及基层医疗诊所有潜在的应用前景。（4）一步巢式PCR结合CRISPR-Cas12a一体化可视化核酸检测方法。采用硅基磁珠提纯病毒RNA后,无需RNA洗脱,可直接加入一步巢式PCR扩增液启动反应;而后取扩增产物进行CRISPR-Cas12a可视化检测,无需借助仪器设备读取检测信号,通过反应前后溶液颜色变化肉眼即可读取结果。该方法靶向检测SARS-Co V-2的ORF1ab和N基因的检测限分别为120 copies/m L和127 copies/m L,可稳定检测SARS-Co V-2的各个VOC突变株。75例临床样本评估表明,该方法与q PCR的阳性结果一致性达95%,阴性结果一致性达100%。一步巢式PCR/CRISPR-Cas12a一体化可视化检测方法,无需大型仪器支撑,具有和q PCR相当的灵敏度和特异性,有望填补乡镇和社区等基层医疗诊所对核酸高灵敏检测的需求。