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家蚕是重要的经济昆虫,在我国国民经济中具有非常重要的地位,它同时也是鳞翅目的模式昆虫。中国是世界上蚕丝生产大国。随着国际市场上丝绸产品向多样化、高档化趋势发展以及我国茧丝绸生产和产品结构的重大变化,迫切需要提供一批新型原料茧丝特殊用途蚕品种,以提高原料茧的内在品质,促进我国茧丝绸产品结构调整,充分满足市场需求,增强我国丝绸在国际市场上的竞争能力。因此,培育特殊蚕品种(如抗病性、专养雄蚕、限性品种、粗纤度、细纤度、低成本人工饲料育)将成为今后育种研究的重点。
家蚕茧的荧光现象早在20世纪20年代末就被日本人发现,茧层在紫外线照射下有多种色调,通常划分为黄,白,紫三种基本型或黄白型和兰紫型两大类。实验表明茧色荧光与缫丝解舒有非常密切的关系,黄荧光茧色解舒好,紫荧光茧色解舒差。茧色荧光是可以遗传的,品种之间存在差异,因此,通过育种是可以获得黄荧光茧色的品种。虽然很早就发现了家蚕茧的荧光现象,而且自此以后很多的研究人员都对这一现象作了研究,但一直停留在传统的遗传学分析上。本论文从DNA入手利用RAPD技术筛选与家蚕荧光茧色基因连锁的分子标记,并转换成SCAR标记,为分子标记辅助育种育种奠定基础。然后在RNA水平上采用荧光差异显示技术研究了家蚕荧光茧色相关基因。最后用使用蛋白层析系统,凝胶电泳技术和MALDI—TOF—TOF质谱仪初步分析了荧光物质。其主要研究结论如下:
1.以家蚕荧光茧品系C408黄和C408紫的基因组DNA为模板,用400多个RAPD随机引物进行筛选实验,获得了一个与家蚕荧光茧色基因相关的分子标记CFP—01859。对这个标记进行了克隆、测序,再设计特异引物转换成SCAR标记验证,证明此分子标记真实可靠。通过生物信息学对测序片段进行分析,发现该片段序列位于家蚕基因组Contig014171(SilkDB)上,在家蚕基因组中是单拷贝的,表明这一序列可作为家蚕紫茧色荧光的分子标记。进一步分析发现该序列的上下游附近没有明显的基因序列,这就暗示所获得的特异片段与控制家蚕茧色荧光的基因还有一定的距离,或者说这个片段可能起着调控某种与茧色荧光基因的作用。
2.通过荧光差异显示技术,在家蚕荧光茧品系C408黄和C408紫中获得了与荧光茧色相关的20多个特异条带。生物信息学分析后得到一个乙醇脱氢酶的部分片断,5’—RACE获得了一个1104bp的全长序列。该序列包含一个822bp的开放阅读框,编码274个氨基酸残基,分子量约为29659Da,等电点约为8.21,具有保守的短链乙醇脱氢酶结构域。基因GenBank号:DQ512730,该基因在家蚕中为首次发现。
3.利用蛋白层析系统和凝胶电泳技术分离得到比较纯的荧光物质,通过乙醇变性等方法,研究了该荧光物质的性质,实验表明该荧光物质分子量比较小,耐高温,日照,对乙醇等有机溶剂不敏感。通过质谱分析,得到与之相关的蛋白的—肽段,希望通过设计简并引物获得该基因,但未能成功。