中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)俗称河蟹,是一种重要的经济蟹类,在我国淡水养殖产业中占有很大的比重。然而,近年来随着其养殖规模的扩大和集约化程度的不断提高,由细菌、病毒以及寄生虫等病原引起的各种疾病日益严重,给中华绒螯蟹养殖业的发展造成了巨大的经济损失,其中颤抖病是中华绒螯蟹中最严重的病害之一。王文等通过组织病理学的观察、细菌分离培养、分类地位的研究以及人工回感实验等证实颤抖病的病原是一种特殊的细菌——螺原体,并正式将它命名为中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasma eriocheiris)。前期研究表明,中华绒螯蟹螺原体主要通过河蟹的鳃或其体表进入河蟹体内,首先侵染其靶细胞——血细胞,再在血细胞中大量繁殖并随血液循环进一步侵染河蟹的神经和肌肉等组织,最终引起河蟹的颤抖病,进而导致河蟹死亡。因此鉴于中华绒螯蟹螺原体的特殊性以及对河蟹的致病性,对河蟹的免疫防御机制做进一步研究显得尤为重要。本硕士论文在前期研究的基础之上,通过基因克隆、生物信息学分析、蛋白原核表达、基因干扰,研究两种河蟹蛋白即组织蛋白酶D和丝氨酸蛋白酶抑制剂3(EscatD和Esserpin-3)在螺原体侵染河蟹的免疫反应机制中发挥的作用。本论文将为进一步探究螺原体在侵染过程中的河蟹免疫防御机理以及减少螺原体对河蟹养殖业的危害提供一定的理论依据。本论文研究结果主要包括以下三个方面:1. EscatD基因克隆、生物信息学分析、蛋白原核表达以及相关功能的研究以河蟹的血细胞cDNA为模板,通过PCR成功扩增了中华绒螯蟹组织蛋白酶D (EscatD)。该基因的cDNA全长序列为2748 bp,其中5’非翻译区(UTR)140bp,3’UTR 1450bp,开放阅读框1158bp,编码385个氨基酸,分子量约为41.66 kDa,等电点为6.53。序列分析表明,EscatD蛋白由信号肽、前体域和成熟域3部分组成。同源性分析表明,EscatD的氨基酸序列高度保守,与水生甲壳类动物相似性在80 %以上。进化分析表明,EscatD与虾类的亲缘关系比较近,与传统分类结果基本一致。构建了原核表达质粒pET-28a-EscatD,诱导表达获得了以包涵体形式存在的重组蛋白EscatD。组织表达结果发现,EscatD在被检测的所有器官中都有表达,其中在河蟹的眼柄、血细胞、肠和神经组织中表达量都相对较高,在心脏、肌肉和鳃中的表达量较少。上述结果为进一步开展EscatD的功能研究奠定重要基础。2. EscatD免疫功能的初步研究EscatD属于组织蛋白酶D家族的一员,近期的研究表明EscatD蛋白在甲壳动物的先天性免疫反应中发挥着重要的作用。qRT-PCR结果显示,在螺原体刺激河蟹血细胞后,EscatDmRNA的转录明显高于对照组(PBS组)。靶基因干扰后,EscatD下游基因JNK、ERK、P38和Relish的基因表达量均有所下降,螺原体感染河蟹的血细胞后,与阳性对照组相比螺原体的拷贝数明显增加,河蟹死亡率明显升高,进一步说明EscatD在河蟹应对螺原体的刺激中发挥着重要的免疫作用。3. Esserpin-3免疫功能的初步研究Esserpin-3属于丝氨酸蛋白酶抑制剂3家族的一员,近期的研究表明Esserpin-3蛋白在甲壳类的先天性免疫反应中发挥着重要的作用。qRT-PCR技术检测表明,螺原体刺激河蟹血细胞后,Esserpin-3mRNA的转录明显高于对照组(PBS组)。靶基因干扰后,Esserpin-3的上游基因LGBP的表达量升高,下游基因proPO的表达量升高;螺原体感染河蟹血细胞后,与阳性对照组相比螺原体的拷贝数减少,河蟹的死亡率明显降低,进一步说明Esserpin-3在河蟹应对螺原体的刺激中发挥着重要的免疫作用。