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目前,人们的消费和市场走向迫使家禽业在蛋禽育种时,选留具有高繁殖性能的个体,而母禽的繁殖性能特别是产蛋率的高低主要取决于卵泡的发育状况。因此,家禽卵泡发育的研究成为了解禽类繁殖机能调控和提高家禽产蛋性能的理论基础。此外,家禽卵泡以其独特的特征优势成为研究卵巢和卵泡发育理想的生物学模型。大量的研究表明,家禽卵泡的生长发育和成熟是在一系列激素和生长因子的精确调控下进行。本实验以鸡为研究对象,一方面研究了鸡卵巢发育过程中一系列形态变化,另一方面研究了表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、干细胞因子(stem cell factor, SCF)及Ghrelin对产蛋鸡小黄卵泡颗粒细胞和膜细胞及18日胚龄鸡胚卵巢生殖细胞生长发育的调控及其机制,为提高家禽繁殖性能提供理论依据。1.产蛋鸡卵泡发育的组织学研究家禽卵泡发育是一个复杂的生理过程,伴随着形态结构的变化。组织结构决定其生理功能,因此,卵泡发育形态结构的研究有助于家禽卵泡发育调控机理的研究。本实验通过组织学方法研究鸡卵泡发生发育过程中的形态学变化。结果表明：孵化至第6天,原始生殖细胞已经迁移到生殖嵴,并与生殖嵴共同形成未分化的性腺；孵化至第9天,性腺已经分化,卵巢特征性结构开始出现,胚胎后期卵巢皮质内卵母细胞聚集成簇。原始卵泡的发育在出生以后开始启动,性成熟母鸡的卵泡呈等级发育,颗粒细胞和膜细胞在形态和增殖特性上具有等级阶段特异性。以上结果表明,家禽卵泡发育是一个以形态变化为特征的生长过程,由卵母细胞的成熟和卵泡细胞的生长发育两部分构成。2.表皮生长因子对鸡等级前卵泡发育的影响家禽卵巢卵泡的选择受内/自/旁分泌因子的影响,由复杂的循环激素和局部因子综合调控。促卵泡素(FSH)和EGF在家禽卵泡发育过程中起决定性作用,具有代表性意义,两者作用的机制及其互作方式值得深入研究。本实验旨在研究EGF对产蛋鸡等级前卵泡发育的调节作用。EGF及其受体(EGFR)mRNA在鸡等级前卵泡高度表达,包括大白卵泡(LWF)和小黄卵泡(SYF),然后随着卵泡的发育逐渐降低。体外悬浮培养的全卵泡经EGF及FSH单独或联合处理24 h后,LWF和SYF的颗粒层和膜层厚度及颗粒细胞密度均显著增加(P<0.05),且以EGF与FSH联合处理组最为显著。EGF和FSH的处理可以提高卵泡中颗粒细胞的有丝分裂率。体外培养的颗粒细胞经0.1～100 ng/ml的EGF或FSH单独处理24 h后出现增殖现象,且增殖强度与剂量正相关。EGF或FSH可以显著增加颗粒细胞核增殖抗原(PCNA)表达和抑制细胞凋亡(P<0.05)。EGF可以显著增加EGFR、FSH受体(FSHR)和细胞周期调控蛋白(CCND1/CDK6和CCNE1/CDK2) mRNA的表达(P<0.05),却明显下调促黄体激素受体(LHR) mRNA的表达(P<0.05)。EGF或FSH引起的颗粒细胞数目和PCNA-LI升高及凋亡发生率降低等效应均被EGFR抑制剂AG1478所拮抗。以上研究结果表明,EGFIEGFR在鸡卵泡发育过程中表达具有阶段特异性；EGF通过促进细胞有丝分裂、抑制细胞凋亡、调控细胞周期及协同FSH而促进鸡等级前卵泡颗粒细胞的增殖,从而调节等级前卵泡的发育。3.碱性成纤维细胞生长因子对鸡胚卵巢和等级前卵泡发育的影响bFGF是一种局部自分泌或旁分泌的有丝裂原,参与调节组织发育和细胞功能的不同过程。本实验首先观察bFGF的受体(FGFR1)在鸡胚卵巢和成年产蛋鸡等级前小黄卵泡中的表达情况,然后观察bFGF对鸡胚卵巢生殖细胞和等级前卵泡颗粒细胞发育的影响。结果表明,FGFR1在]8日胚龄鸡卵巢的皮质和髓质的细胞中广泛表达,在鸡小黄卵泡的颗粒层中强表达。在体外,bFGF(0.1-100ng/ml)对鸡胚卵巢生殖细胞和小黄卵泡颗粒细胞呈剂量依赖方式增殖,但这种增殖作用被FGFR1抑制剂(SU5402)显著阻断；蛋白激酶C(PKC)激活剂佛波酯(PMA)能显著增强bFGF (10 ng/ml)的促上述细胞增殖作用(P<0.05),PKC抑制剂H7却可以显著抑制此作用(P<0.05)；而蛋白激酶A (PKA)激活剂佛司可林(FRSK)和PKA抑制剂H89对此作用没有显著影响。此外,向鸡胚内注射bFGF后对细胞计数的结果进一步证实了bFGF可以促进鸡胚卵巢生殖细胞的增殖。经bFGF (10 ng/ml)处理后,鸡等级前小黄卵泡颗粒细胞细胞周期调控基因CCND1ICDK6和CCNE1ICDK2 mRNA丰度显著升高,而H7可显著抑制bFGF上调以上四种基因表达的作用。bFGF通过与细胞膜表面受体FGFR1结合,启动PKC信号转导途径,调控细胞周期,发挥促细胞增殖作用,从而调节鸡胚卵巢生殖细胞和等级前卵泡的发育。4.干细胞因子对鸡等级前卵泡膜细胞增殖的影响SCF是最早发现的促进卵泡募集的旁分泌因子,在卵巢中,主要由颗粒细胞表达,被誉为“膜细胞的组织者”,参与膜细胞的募集和分化。本文通过体外细胞培养和免疫组化方法探讨SCF对鸡等级前卵泡膜细胞增殖作用及参与的信号转导途径。鸡小黄卵泡膜细胞在体外预培养16h后,经SCF(0.1～100ng/ml)处理24 h后膜细胞显著增殖(P<0.05),其凋亡发生率亦被显著抑制,上述效应呈现出一定的剂量依赖性。SCF处理可以增加膜细胞c-Kit的表达,同时SCF的促增殖作用被c-Kit抗体所抑制。向培养体系中添加PKC信号转导途径的激活剂PMA或抑制剂H7后,SCF促膜细胞增殖作用将分别被显著增强或抑制。PKA信号转导途径激活剂FRSK和抑制剂H89对SCF的促膜细胞增殖作用无明显影响。以上结果表明,SCF通过与细胞表面c-Kit结合,在PKC信号转导途径参与下,发挥其促小黄卵泡膜细胞增殖的作用,从而调节等级前卵泡的发育。5. Ghrelin对鸡等级前卵泡发育的影响Ghrelin是一种主要由胃肠道分泌产生的多肽,具有促进生长激素分泌、促进摄食、参与能量代谢等多种生理作用。近年来研究表明,Ghrelin及其受体(GHSR)在卵巢组织中的表达并在卵泡发育中起调节作用。本实验旨在研究Ghrelin对产蛋鸡等级前卵泡发育的调节作用。首先通过RT-PCR法检测卵泡GHSR的表达情况,然后利用全卵泡培养和颗粒细胞单独培养模型结合组织学和免疫组化方法探讨了Ghrelin对鸡等级前卵泡形态和颗粒细胞增殖的影响及相关机制。结果表明,GHSR mRNA在颗粒层和膜层上均有表达,其表达量随着卵泡的发育先而逐渐上升,至LWF和SYF阶段升至最高,随后逐渐降低。悬浮培养的卵泡经100 ng/ml的Ghrelin处理24 h后,LWF和SYF的颗粒层和膜层厚度及颗粒细胞密度均显著增加(P<0.05)。鸡小黄卵泡的颗粒细胞在体外预培养12h后,用1-1000 ng/ml的Ghrelin处理24 h,细胞增殖效应呈现出剂量依赖性。颗粒细胞经100 ng/ml的Ghrelin处理后,PKA和PKC阳性率显著上升(P<0.05)；H89及H7能够显著抑制Ghrelin的促颗粒细胞增殖作用,而FRSK及PMA作用正好与之相反。同时,体外培养的颗粒细胞和悬浮培养卵泡的颗粒细胞中层粘连蛋白(LN)和缝隙连接蛋白43(C×43)的标记率显著提高(P<0.05)。上述结果提示,Ghrelin可通过PKA和PKC信号转导途径和提高LN和Cx43的表达以增强颗粒细胞连接功能,促进鸡等级前卵泡颗粒细胞的增殖,从而调节卵泡发育。总之,本实验通过形态学和免疫组化方法研究了产蛋鸡卵巢发育过程中卵泡形态学变化特点；通过将局部生长因子(EGF、bFGF和SCF)及Ghrelin作用于全卵泡或不同卵泡细胞体外培养,发现他们分别与各自的受体结合并通过蛋白激酶信号途径促进细胞增殖,揭示了上述卵巢局部性促生长因子对卵泡发育的调控作用及其机理。这些结果必将为阐明家禽卵泡发育和优势卵泡选择的调控机理及提高家禽繁殖性能奠定一定的理论基础。