论文部分内容阅读
第一部分：大黄素促THP-1巨噬细胞胆固醇外流及PPAR-γ通路活化目的：动脉粥样硬化(atherosclerosis)是严重威胁人类健康的心脑血管疾病之一。巨噬细胞源性泡沫细胞在动脉粥样硬化形成和发展中扮演十分重要的角色。胆固醇摄取和外排失衡是泡沫细胞形成的一个重要原因。大黄素是一个天然的活性成分,具有广泛的抗炎、抗肿瘤、降血脂等功效。多项研究表明,大黄素具有激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)通路的功能。本研究大黄素是否可通过激活PPAR-γ通路促进巨噬泡沫细胞胆固醇外流。方法：人单核细胞株THP-1应用100 nmol/L佛波酯处理72小时,分化为巨噬细胞,利用细胞免疫荧光染色检测巨噬细胞表面抗原(Cluster of differentiation 14, CD14)、CD11b和CD11c的表达。THP-1巨噬细胞加入50μg/ml的ox-LDL和0.2 μCi/ml 3H标胆固醇,培养24小时,油红O染色分析脂质沉积。THP-1巨噬细胞加入50μg/ml ox-LDL,培养24小时。然后加入10μg/ml载脂蛋白A-I(ApoA-Ⅰ)和不同浓度的大黄素(0、1、5和10μM)培养18小时；或者加入10μg/ml ApoA-Ⅰ和10μM的大黄素培养0、4、8、12、16、18和24小时。对于PPAR-γ的抑制试验,在加入大黄素之前1小时需要加入不同浓度的GW-9662(0、1、5和10μM),或者预先转染PPlAR-γ siRNA(20、40和80 nM的)孵育24小时后加入大黄素,继续培养18小时。PPAR-γ siRNA序列为：5’-GGAUGCAAGGGUUUCUUCCtt-3’和5’-GGAAGAAACCCUUGCAUCCtt-3’应用闪烁计数法检测培养液和细胞的3H胆固醇,计算胆固醇流出率。抽提细胞总RNA,应用逆转录PCR法检测PPAR-γmRNA表达水平变化；抽提细胞总蛋白,应用Western blot法检测PPAR-γ蛋白表达水平变化。结果：PMA孵育72小时能够促进THP-1细胞表达巨噬细胞标志分子CD14、CDllb和CDllc,而对照细胞不表达这些表面抗原分子。PMA刺激分化的THP-1巨噬细胞和50μg/ml的ox-LDL共同孵育后18小时后,细胞内形成脂滴,油红O染色呈现红色圆形颗粒状。不同浓度的大黄素(1、5和10μM)处理ox-LDL刺激的THP-1巨噬细胞18小时后,PPAR-γmRNA/β-actin mRNA的比值分别为：1.592+0.256,2.571+0.193,3.591+0.218与对照组相比(1+0.191)均显著升高。大黄素对PPAR-γmRNA表达的促进作用从4小时开始持续到18小时,与对照相比差异十分显著(P<0.01)。不同浓度的大黄素(1、5和10μM)处理ox-LDL刺激的THP-1巨噬细胞18小时后,PPAR-γ蛋白/[-actin蛋白的比值分别为：1.419+0.296,2.617+0.252和3.417+0.296。大黄素处理组与对照组相比(1+0.162)均显著升高。大黄素对PPAR-γ蛋白表达的促进作用在8小时后开始(2.169+0.173相对于0.976+0.105,P<0.01),直到18小时(3.812+0.265相对于0.982+0.115,P<0.01)。载脂蛋白A-I处理ox-LDL刺激的THP-1巨噬细胞中胆固醇的外流率为7.62+0.61%,与对照组胆固醇外流率(2.12+0.32%)相比显著增加(P<0.01)。5μM(10.74+0.93%)和10μM(16.29+1.48%)大黄素能够显著促进载脂蛋白A-I诱导的胆固醇外流。GW9662(5-10μM)对大黄素诱导的胆固醇外流具有显著的抑制效应(P<0.01)。与对照组相比,转染PPAR-γsiRNA后,细胞内PPAR-γ蛋白/β-actin蛋白的比值显著降低(P<0.01)。转染PPAR-γ特异性 siRNA(20-40μM)显著抑制大黄素诱导的胆固醇外流。结论：本研究首次证实大黄素对巨噬泡沫细胞胆固醇外流具有促进功能,并且大黄素促胆固醇外流效应与激活PPAR-γ通路有关。第二部分：大黄素通过激活LXR-α介导ABCA1和ABCG1转录促进胆固醇外流目的：ATP结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter, ABC)家族以ATP为能源对多种底物包括各种代谢物,脂质,细胞毒素和药物等进行转运。ABCA1和ABCG1通过介导胆固醇主动转运,将胆固醇运至apoA-I载脂蛋白,从而阻止巨噬泡沫细胞形成。肝脏X受体α(LXRα)具有与ABCA1和ABCG1基因启动子区结合并启动基因表达的能力。PPAR-γ对胆固醇外流重要基因ABCA1和ABCG1的调控作用依赖于LXR-α的转录活性。考虑到PPAR-γ与LXR-α的紧密关系,本部分拟继续研究大黄素促胆固醇外流是否与激活LXR-α介导ABCA1和ABCG1转录有关。方法：THP-1单核细胞应用100nmol/L佛波酯诱导72小时使其分化为巨噬细胞。在THP-1巨噬细胞中加入50μg/ml的ox-LDL,培养24小时。然后加入10μg/ml载脂蛋白A-I及不同浓度的大黄素(0、1、5和10μM)培养18小时；或者加入10μg/ml载脂蛋白A-I和10μM的大黄素培养不同时间点(0、4、8、12、16、18和24小时)。而对于PPAR-γ的抑制试验,在加入大黄素之前1小时需要加入不同浓度的GW-9662(0、1、5和10μM),然后再培养18小时。抽提细胞总RNA和总蛋白,检测LXR-α、PPAR-γ、ABCA1和ABCG1表达变化情况。结果：RT-PCR检测结果表明：大黄素(1、5和10μM)处理ox-LDL刺激的THP-1巨噬细胞18小时后,LXR-α mRNA/β-actin mRNA的比值分别为：1.671±0.265,2.726±0.306,3.198±0.358,这与对照组相比(1±0.188)显著增加。Western blot检测结果表明,不同浓度的大黄素(1、5和10μM)处理ox-LDL刺激的THP-1巨噬细胞18小时后,LXR-α蛋白/β-actin蛋白的比值分别为：1.571±0.199,2.169±0.266,2.919±0.311,而对照组为(1±0.156)。与对照组相比,10μM大黄素能够显著增强PPAR-γ蛋白表达(P<0.01)。5μM和10μM的GW9662处理的细胞中的PPAR-γ蛋白/β-actin蛋白的比值与单纯的大黄素处理的细胞中PPAR-y蛋白/β-actin蛋白的比值显著减少。与此类似,GW9662也可以抑制由大黄素促进的LXR-α蛋白的表达。不同浓度的大黄素(5和10μM)处理ox-LDL刺激的THP-1巨噬细胞18小时后,ABCA1 mRNA/p-actin mRNA的比值分别为1.761+0.296和3.266+0.334,与对照组(1+0.077)相比显著增加；ABCGl mRNA/ β-actin mRNA的比值分别为1.662+0.207和2.952+0.326,与对照组(1+0.182)显著增加。在蛋白水平上,不同浓度的大黄素(1、5和10μM)处理ox-LDL刺激的THP-1巨噬细胞18小时后也同样导致ABCA1和ABCG1蛋白水平显著增加。PPAR-γ特异性抑制剂GW9662(5μM和10μM)显著抑制大黄素诱导的ABCA1和ABCG1蛋白表达水平。结论：本研究首次证实大黄素在巨噬泡沫细胞胆固醇外流中的促进作用与上调LXRα、ABCA1和ABCG1有关。PPAR-γ通路活化参与了大黄素诱导LXRα、 ABCA1和ABCG1的表达,进而增强胆固醇外流。