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利用核移植技术生产转基因动物对农业生产和生物医学领域具有重要的应用价值。然而,核移植的总体效率较低,而且核移植动物存在多种异常表现,严重限制了该技术的广泛应用。而且转基因核移植技术操作步骤繁琐,全世界仅个别实验室可以利用该技术批量生产转基因动物。为了生产抗乳腺炎转基因奶山羊,本研究对山羊体细胞核移植体系和转基因供体细胞的制备进行了一系列优化。1.研究了激活时间、细胞松弛素B(CB)处理、胚胎培养条件、移植时间和移植胚胎数等因素对山羊核移植胚胎体内和体外发育的影响。结果显示,融合后2和3 h 90%以上的供体核显示浓缩型和中期样的染色体形态,而且激活后的囊胚率显著高于1、4和5 h的胚胎(P < 0.05);CB处理组的囊胚发育率(24.8% vs. 17.7%; P < 0.05)和克隆胚胎早期妊娠率显著高于对照组(31.3% vs. 10.3%; P < 0.05),有4只克隆羊出生;每只受体移植20和30枚胚胎组的胎儿存活率高于10和40枚组。结果表明,融合后胚胎在CB中处理2～3 h再激活,可提高山羊克隆胚胎的体内和体外发育能力,每只受体移植20～30枚早期克隆胚胎,早期妊娠率稳定在45%以上和胎儿出生率为38.2%。2.研究了不同胎儿成纤维细胞系的增殖能力、染色体稳定性、细胞周期和凋亡、转染效率和转人溶菌酶基因克隆山羊的生产效率。结果显示,5个细胞系(GFF1、GFF2、GFF3、GFF4和GFF5)中增殖能力和染色体稳定性:GFF1、GFF2>GFF4、GFF3;处理后G1/G0期细胞比例GFF4>GFF3、GFF5>GFF2>GFF1;细胞凋亡:GFF4<GFF1、GFF5<GFF3<GFF2;转基因效率:GFF2、GFF1>GFF5、GFF4、GFF3;不同转基因细胞系克隆胚胎体外发育能力:F2C11≥F3C1、FC3、F1C7、F3C2、F2C2>F5C3、F5C3;转基因克隆胚胎体内发育能力:FC3、F1C7>F3C1、F3C2。结果说明,来源不同胎儿的成纤维细胞系的增殖能力和染色体稳定性不同,增殖能力和染色体稳定性较高的细胞系转染后的克隆形成率和扩增率较高,此外各转基因细胞系的核移植效率差异显著,转基因核移植过程中应当选择多个转基因细胞系作为供体细胞,可以降低风险;本研究获得健康转人溶菌酶基因克隆山羊,早期妊娠率为30%,核移植效率1.2%。3.利用转基因核移植技术生产转人β-防御素3(Human beta-defensin-3,HBD3)基因克隆山羊。结果显示,共获得7个转基因阳性细胞克隆,以其中两个转基因细胞系为供体细胞构建克隆胚胎,30 d的妊娠率为40.5%(32/79),妊娠到期的比例为21.5%(17/79),17只羊分娩产下26只小羊,产羔率为32.9%(26/79)其中多胎率为35.3%(6/17),核移植总体效率为1.4 %。通过PCR和Southern杂交鉴定,9只存活的小羊全部为转基因羊,拷贝数为5个左右,反向PCR鉴定整合位点5’端距离β-乳球蛋白前体基因(beta-lactoglobulin precursor)1587 bp,3’端距离糖基转移酶6蛋白1基因9598 bp(glycosyltransferase 6 domain-containing protein 1)。4.利用Tricine SDS-PAGE电泳及Western Blot检测目的基因HBD3的表达,并以纯化的转基因山羊乳腺上皮细胞进行了继代克隆,研究继代克隆对核移植效率的影响。结果表明,转基因羊乳腺上皮细胞经过诱导可分泌人防御素3蛋白;转基因羊乳腺上皮细胞(TGMEC)克隆胚胎的融合率、卵裂率和囊胚发育率与非转基因羊乳腺上皮细胞(GMEC)的克隆胚差异不显著,但两组实验的融合率较低(分别为54.5%和49.7%),早期妊娠率为20%,但没有获得克隆后代。结果说明,继代核移植不能提高转基因克隆胚胎的发育能力。本论文开展的系列研究,对于完善山羊转基因核移植技术体系,批量生产转基因抗病动物,具有重要的应用价值。