论文部分内容阅读
目的:通过观察黄芩素（Baicalein）对糖尿病（DM）大鼠视网膜组织以及血清中的RAGE/ICAM-1/NF-κB信号通路相关因子表达的影响,研究并探讨黄芩素对糖尿病大鼠视网膜病变的延缓作用及相关机制,为其临床上应用于糖尿病视网膜病变（Diabetic Retinopathy,DR）的治疗提供实验依据。方法:1.实验动物及分组选择8周龄、体重220 g（220g±14g）的雄性SD（SPrague-Dawley）大鼠30只,饲养温度22~25℃,湿度45%~65%,昼夜光循环交替,自由饮水、进食,标准饲料喂养,室内通风良好。待进行一周适应性喂养后,随机分为3组,分别是:正常对照组（CON）;糖尿病模型组（DM）;黄芩素治疗组（Baicalein）。每组10只。2.模型建立DM组和Baicalein组SD大鼠禁食20 h后一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ,剂量:50 mg/kg）诱导糖尿病,CON组大鼠给予一次性腹腔注射等体积的0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液。在注射完成72 h后尾静脉取血检测大鼠空腹血糖（FPG）浓度,测空腹血糖应禁食12h,1周以后复查;成模标准为空腹血糖≥16.7 mmol/L,出现明显多饮多尿症状;三组大鼠均正常自由进食水。3.干预方法待1周复查符合成模标准后,Baicalein组大鼠给予150 mg/kg的黄芩素（溶于0.9%氯化钠溶液中）灌胃,同时CON组和DM组给予等量的0.9%氯化钠溶液灌胃,每日清晨一次,连续灌胃8周。4.取材、检测方法及观察指标:观察并且记录各组大鼠的一般状态,包括体型、皮毛、精神、食欲、饮水、尿量等状态,每2周用血糖仪检测FPG,血糖仪测试上限为33.3mmol/L,超过33.3mmol/L会显示HI（HIGH）,结果均取最高值。8周灌胃结束后各组大鼠禁食禁水12 h,采集大鼠尾静脉血液检测FPG,称重,给予3-4%异氟烷诱导,1-2%维持,流量0.2-0.3L/min吸入麻醉,心脏取血,分离上清液用于酶联免疫吸附试验（ELISA）测定各组大鼠血清中白细胞介素-6（IL-6）、白介素细胞-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平。加大异氟烷浓度到5%处死大鼠,即刻摘取各组大鼠右眼眼球,制备石蜡切片,分别用于苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining,HE）和免疫组化。HE染色观察大鼠视网膜形态结构、组织病理学改变;免疫组化观察并通过Image J软件进行图像半定量分析大鼠视网膜组织中晚期糖基化终产物受体（RAGE）、细胞黏附因子（ICAM-1）的表达;摘取各组大鼠的左眼分离视网膜组织用于蛋白质印迹法（Western blot）检测p-NF-κB p65和NF-κB p65在视网膜细胞核中核转位情况。5.统计学方法:采用SPSS26.0（Statistical Product and Service Solutions26.0）统计分析软件对数据整理、统计和分析。采用Shapiro-Wilk test方法检验数据的正态性情况,采用sx对正态分布的计量资料进行描述,采用方差分析方法,对比分析多组间的正态指标差异情况,组间有差异的采用S-N-K进行两两比较;检验水准为:α（28）05.0,也即是P＜0.05为具有统计学差异。结果:1.大鼠一般状态观察CON组大鼠精神状态良好,皮毛有光泽,食量及饮水量正常,粪便及尿量正常;DM组大鼠成模出现沉默倦怠、蜷缩成堆等状态,食欲及饮水量明显增加,皮毛无光泽,体重呈下降趋势,粪便增多、尿液明显增多并且呈明显黄色,活动、反应灵敏度明显降低等。Baicalein组大鼠饮水量及食量较DM组减少,较CON组增多;精神状态正常,反应灵敏度稍显下降,粪便增多但略稀,尿量增多。2.各组大鼠血糖结果:DM组大鼠和Baicalein组大鼠2周、4周、6周、8周血糖均高于CON组（均为P＜0.01）;Baicalein组大鼠6周、8周血糖分别低于DM组6周、8周血糖（均为P＜0.01）。3.HE染色结果:CON组大鼠视网膜组织结构清晰,层次完整,细胞大小基本一致;DM组大鼠视网膜组织出现水肿,神经节细胞层呈空泡样改变,细胞间隙明显增大,数量明显减少,各层之间层次不清,细胞排列紊乱。Baicalein组对比DM组大鼠视网膜结构较完整,神经节细胞层未见明显空泡、肿胀,排列相对整齐,细胞间隙较CON轻度增大、较DM组减小,各层之间水肿较DM组明显减轻。4.各组视网膜免疫组化显示:CON组大鼠视网膜基本没有RAGE及ICAM-1的表达,DM组大鼠视网膜RAGE及ICAM-1的光密度值增大,表达增强,而Baicalein组大鼠视网膜RAGE及ICAM-1的表达明显降低,光密度值减小,具有统计学意义（P＜0.01）。5.血清ELISA结果显示:DM组大鼠血清中IL-1β的浓度显著升高,与CON组及Baicalein组相比均有非常显著性差异（P＜0.01）,而Baicalein组和CON组之间血清中IL-1β的浓度无统计学意义（P＞0.05）。三组大鼠血清中的IL-6浓度不同（P＜0.001）,DM组明显升高,Baicalein组虽与CON组相比升高但与DM组相比,血清IL-6浓度明显降低（P＜0.001）。三组大鼠血清中的TNFα浓度不同（P=0.005）,DM组的TNFα显著增高,高于CON组和Baicalein组（P＜0.01）,Baicalein组和CON组之间不存在统计学差异（P＞0.05）。6.视网膜Western blot结果:三组间的NF-κBP65不存在统计学差异（P=0.512）;三组间的P-NF-κBP65不同（P＜0.001）,DM组的P-NF-κBP65高于Baicalein组高于CON组;差异具有统计学意义。结论1.通过STZ诱导所建立的糖尿病大鼠模型与人类患糖尿病时的临床表现基本一致,是建立糖尿病模型准确率较高的方法。2.全身应用黄芩素对糖尿病大鼠的血糖有一定的降低作用。3.全身应用黄芩素可以降低血清中的IL-1β、IL-6以及TNF-α的浓度,抑制视网膜组织中RAGE受体蛋白及ICAM-1黏附因子的表达,减轻糖尿病大鼠早期视网膜组织结构的损害。4.通过抑制糖基化终末产物与其配体RAGE结合进而减少ICAM-1黏附因子的表达来抑制核转录因子的NF-κB的激活及炎症因子的释放可能是黄芩素延缓早期糖尿病大鼠视网膜病变进程的作用机制之一。