肺癌是一种常见的恶性肿瘤，其死亡率占癌症死亡率之首。其中非小细胞肺癌占70％～80％，而肺腺癌是非小细胞肺癌的主要病理类型。化疗是肺腺癌主要的治疗手段，培美曲塞作为新一代的化疗药物，是多靶点抗叶酸代谢药物，近年来在肺腺癌的一线治疗中广泛应用。然而在临床工作中发现其疗效存在明显的个体差异，提示在不同的个体中存在影响培美曲塞敏感的相关因素。　　随着药物基因组学的发展，耐药基因的表达是影响化疗药物敏感的关键。通过寻找耐药基因并分析其与化疗药物敏感性的关系来预测疗效，进而指导临床选择有效的化疗药物已经受到广泛关注。体外实验已经证实胸苷酸合成酶(thymidylate sythase，TS)、非受体酪氨酸激酶Src的表达与培美曲塞的疗效相关。肺腺癌细胞中胸苷酸合成酶的高表达将降低其对培美曲塞的敏感性。在人类正常细胞中存在的Src基因为c-Src，作为原癌基因其编码Src酪氨酸激酶。研究发现Src在上皮肿瘤组织中表达及活性均较高，并且常常与肿瘤发展阶段和恶性程度相关。Src包含SH1、SH2、SH3共3个功能结构域，SH1激酶域含有正调节自主磷酸化位点Y416，SH2蛋白区域和SH1激酶域为细胞信号转导必需，SH3蛋白区域则对细胞骨架的重组和Src蛋白转运方面具有重要意义。体外实验发现Src在肺腺癌细胞的活性直接影响以TS为靶酶的培美曲塞的疗效，但Src与TS参与培美曲塞耐药的机制尚不明确，Src基因可能通过对TS的调控影响培美曲塞的敏感性。因此，本研究探讨了Src与TS在肺腺癌组织及细胞中的表达及其参与培美曲塞耐药的机制。实验内容主要包括以下三部分。　　第一部分、胸苷酸合成酶、Src酪氨酸激酶在肺腺癌中的表达及其临床意义　　目的:采用实时定量PCR和免疫组化方法检测肺腺癌组织TS、SrcmRNA及蛋白的表达，试图了解肺腺癌组织TS及Src的表达情况、认识影响培美曲塞敏感性的临床病理特征及其规律，探讨TS及Src与肺腺癌预后的关系。　　方法:采用免疫组织化学方法检测100例肺腺癌患者术后癌组织及相对应的癌旁组织中的TS、Src蛋白的表达情况，实时定量PCR法检测TS、Src的mRNA表达，病例来自2008年1月至2013年1月唐山市三家三级甲等医院，同时收集每个患者的临床病理资料，并对每一位患者进行预后随访;统计学处理采用SPSS17.0统计软件，计数资料中率的差异性使用x2检验或校正的x2检验，采用非参数Spearman等级相关分析法分析等级资料，用Kaplan-Merier法及Log-rank检验进行单因素生存分析，采用COX比例风险模型的统计学方法进行多因素生存分析，分析TS、Src的表达与肺腺癌预后的关系，P＜0.05具有统计学意义。　　结果:免疫组化结果显示:肺腺癌组织中TS和Src蛋白阳性表达率均高于癌旁组织（均P＜0.05）;TS蛋白表达水平与肿瘤分化程度、临床分期、淋巴结转移、吸烟密切相关，有吸烟史、组织分化程度低、临床分期晚、有淋巴结转移的患者TS蛋白均高表达（均P＜0.05）;但年龄、性别、肿瘤大小与TS蛋白表达无关（均P＞0.05）。而Src蛋白的表达仅与吸烟、肿块大小及淋巴结转移密切相关（均P＜0.05）。实时定量PCR结果显示:TS、Src的mRNA与肿瘤组织分化程度相关（P＜0.05）。Kaplan-Merier法显示TS及Src表达与无病生存期(Disease-free survival，DFS)、总生存期(Overall survival，OS)之间存在负相关(P＜0.05，r=0.23)。COX比例风险模型分析显示:TS、Src表达均可能是影响肺腺患者预后的独立危险因素。　　结论:　　1.TS和Src在肺腺癌组织高表达与肺腺癌细胞分化程度低，临床分期晚及淋巴结转移相关;　　2.TS和Src的表达是影响DFS及OS的重要预后影响因素之一。　　第二部分、培美曲塞耐药肺腺癌细胞株的建立及其生物学行为　　目的:肺腺癌细胞对于培美曲塞耐药的机制尚不明确，本研究通过诱导培美曲塞耐药的肺腺癌细胞株，观察其生物学行为，探讨培美曲塞耐药的肺腺癌细胞株的建立方法及其生物学特性，建立培美曲塞耐药的细胞模型。　　方法:采用间歇浓度冲击法应用培美曲塞诱导A549细胞成为耐药细胞株A549/PEM，MTT法检测细胞的增殖抑制率，侵袭实验和划痕实验检测耐药细胞的侵袭转移能力，绘制生长曲线并计算倍增时间，以流式细胞术检测其周期分布情况。　　结果:应用MTT法测得培美曲塞对A549细胞的半数抑制浓度(Inhibitory Concentration50％，IC50)为180.75ng/ml，经过4个月药物反复诱导，成功诱导出耐药指数为27.13倍的人肺腺癌A549耐药细胞株(A549/PEM)，为培美曲塞高倍耐药株。A549/PEM与A549相比倍增时间无明显差异，分别为(62.35±0.89)h和(62.78±1.06)h(P＞0.05)。A549/PEM与A549细胞相比，处于G1/G0期的细胞比例没有变化，处于S期的细胞比例增加（P＜0.05），划痕实验及侵袭实验结果表明耐药株运动侵袭及迁移能力高于亲本株(P＜0.05)。　　结论:　　1.间歇浓度冲击法可诱导出对培美曲塞高倍耐药的肺腺癌细胞株，A549/PEM与亲本株相比，细胞运动能力更强，更具有侵袭性;　　2.A549/PEM与A549相比，A549/PEM细胞周期分布发生变化，主要表现为S期细胞数比例增加，提示细胞增殖能力增强。　　第三部分、胸苷酸合成酶、Src酪氨酸激酶在肺腺癌细胞株中的表达与培美曲塞耐药关系的研究　　目的:培美曲塞耐药涉及多种机制，培美曲塞的疗效与其作用靶点酶TS的表达有关，有研究证实Src的表达与肺腺癌的进展相关。本研究通过mRNA芯片技术和Western blot，对比A549/PEM与A549的基因差异;分析A549/PEM及A549中Src、TS的mRNA及蛋白表达的变化;通过siRNA转染技术沉默Src基因后，观察A549/PEM中TS蛋白的表达及细胞增殖、凋亡的情况，探讨TS、Src在肺腺癌细胞对培美曲塞继发性耐药机制中的作用。　　方法:mRNA芯片分别比对A549/PEM及A549的基因差异。实时定量PCR及Western blot检测TS及Src在A549/PEM及A549中mRNA及蛋白的表达差异。转染c-Src siRNA沉默Src基因表达后，经实时定量PCR及Western blot检测A549/PEM中Src的mRNA及蛋白表达，Western blot法检测TS蛋白的表达，流式细胞仪检测耐药株的凋亡及增殖情况。　　结果:mRNA芯片比对结果发现A549/PEM及A549的基因存在明显差异，Src和TS以及编码Src SH2的mRNA都表达上调（2倍以上增高）。TS及Src在A549/PEM及A549中mRNA及蛋白的表达差异明显，A549/PEM呈高表达(P＜0.05）。转染c-Src siRNA沉默Src基因表达后，经实时定量PCR及Western blot验证A549/PEM中Src沉默，Western blot法检测TS蛋白的表达发现Src沉默后TS表达减少，(P＜0.05）。siRNA转染后耐药株凋亡增加，增殖减少，(P＜0.05）。　　结论:　　1.TS、Src的高表达与肺腺癌培美曲塞耐药机制密切相关;　　2.沉默Src基因可以影响TS的表达进而逆转培美曲塞耐药。