论文部分内容阅读
选题依据:肝癌为临床上常见的恶性疾病,其具有前期不易诊断,晚期致死率高等特点,已威胁到患者的生存质量及生命;目前针对肝癌的化疗方案存在严重的副作用,因此需要寻求肝癌治疗新策略。近年来中药治疗肝癌方面进展迅速,其在改善患者病发症状、减轻痛苦、延长生存期方面发挥着越来越大的作用。针对中药治疗癌症方面的文献调研,其中柴胡在临床应用及药理研究领域占据了一定的席位,其具有抑制肝癌细胞增殖及促进肝癌细胞凋亡的活性。临床上运用柴胡注射液配合TACE技术治疗肝癌取得较好疗效,另有报道市售的柴胡注射液阻滞肝癌细胞于S、G2期,从而抑制其增殖;但是未探究柴胡注射液通过何种机制引起肝癌细胞周期阻滞以及诱导其凋亡;故此亟待解决柴胡注射液抗肝癌作用机制,为以后推广临床用药提供参考。另外柴胡注射液主要含有挥发油类和皂苷类成分等,且皂苷类成分已报道具有抑制肝癌的作用,小极性成分挥发油类未见报道;这提示对柴胡的研究可从挥发油类及皂苷类切入。故此研究柴胡不同极性部位,明确其抗肝癌药效强弱及阐明潜在药效机制,为以后合理开发柴胡在肝癌治疗方面提供参考。目的:筛选柴胡不同极性部位体外抗肝癌药效强弱;研究柴胡不同极性部位及其注射液体外抑制肝癌细胞增殖及促凋亡作用;基于分子生物学结合代谢组学技术探究柴胡不同极性部位及其注射液抑制肝癌细胞增殖及诱导凋亡的机制。方法:采用MTT法考察柴胡小极性部位(LPB)、中极性部位(MPB)、大极性部位(HPB)及柴胡注射液(BI)体外抑制肝癌细胞增殖药效,以5-FU选做阳性对照药;流式细胞仪检测BI、LPB、MPB干预后肝癌细胞周期阻滞及凋亡状况;划痕实验检测BI、LPB、MPB对肝癌细胞迁移的影响;借助qPCR技术检测BI、LPB、MPB干预后肝癌细胞中周期相关基因的变化;借助Western Blot技术检测BI、LPB、MPB干预后肝癌细胞中凋亡及迁移相关蛋白的变化;借助LC-MS代谢组学技术探究正常肝细胞与肝癌细胞中内源性差异物,以及BI、LPB、MPB干预后肝癌细胞中内源性差异物的变化。结果:1.以IC50值范围作为参考,柴胡三极性部位(生药量)间药效强弱按照:MPB(0.226 mg/mL)﹥LPB(0.437 mg/mL)﹥HPB(大于5.952 mg/mL)。2.流式细胞仪及qPCR结果表明:相较于肝癌细胞组,BI干预后肝癌细胞阻滞于S期和G2期,BI组Npas2、CDC25A、CDK2、CyclinA、CDC25B、CDK1、CyclinB1基因表达量显著降低(P﹤0.01 or 0.001)。LPB干预后肝癌细胞主要阻滞于G1期和G2期,LPB组Npas2、CDK1、CDK2、CyclinE、CyclinB1基因表达量显著降低(P﹤0.05);CDC25A,CDC25B呈下降趋势(P﹥0.05)。MPB干预后肝癌细胞阻滞于G2期,MPB组CDC25B、CDK1、CyclinB1基因显著降低(P﹤0.05)。3.流式细胞仪及Western Blot结果表明:BI、LPB、MPB通过凋亡途径诱导肝癌细胞凋亡;BI、LPB、MPB干预后肝癌细胞凋亡增加,Bcl-2蛋白相对表达量显著降低(P﹤0.001),Bax、Bax/Bcl-2、Cyt-C、Caspase-3蛋白的相对表达量显著增加(P﹤0.01 or 0.001)。4.Western Blot结果表明:相较于肝癌细胞组,BI、LPB、MPB组肝癌细胞迁移力减弱,TIMP-1显著增加(P﹤0.001),MMP-9/TIMP-1比值显著降低(P﹤0.01)。5.代谢组学结果表明:BI干预脂质代谢途径、糖酵解途径、胆汁酸途径、氨基酸代谢途径、脂肪酸代谢途径及核苷酸代谢途径;LPB干预糖酵解途径、氨基酸代谢途径、脂肪酸代谢途径和核苷酸代谢途径;MPB干预脂质代谢途径、糖酵解途径、氨基酸代谢途径、胆汁酸代谢途径、脂肪酸代谢途径及核苷酸代谢途径。结论:1.BI介导的S期阻滞可能与下调Npas2-CDC25A-CDK2+CyclinA通路相关;LPB介导的G1期阻滞可能与下调Npas2-CDC25A-CDK2+CyclinE通路相关;BI、LPB、MPB介导的G2期阻滞可能与下调CDC25B-CDK1+CyclinB1通路相关。2.BI、LPB诱导的凋亡机制可能与下调Npas2,CDC25A靶点以及激活线粒体凋亡途径相关;MPB诱导的凋亡机制可能与激活线粒体凋亡途径相关。BI、LPB、MPB抑制肝癌细胞迁移可能与MMP-9/TIMP-1比值下调相关。3.BI、LPB、MPB调控多种内源性物质,调控众多代谢通路,从而诱导肝癌凋亡;体现出中药具有多成分,多靶点的特点。