核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）是一种世界性的危害多种作物的重要植物病原菌，其寄主包括世界上主要的油料作物之一油菜，造成油菜的茎、叶和角果的腐烂，导致严重的产量损失。目前虽然采用“以抗病品种为基础、化学防治为加强措施，辅以其它防治方法”的油菜菌核病综合防治措施，但至今为止还没有发现完全免疫或者高抗的油菜品种，目前抗病品种的抗病水平远远没有达到生产需求，而化学防治成本高、污染环境、花期人工喷药困难，导致实际喷药防治面积很小，利用微生物源制剂的生物防治技术还未能在生产上推广。油菜菌核病的有效防治需要开辟新的途径，研发新的技术。　　在油菜菌核病的侵染循环中，油菜叶和茎病斑的90％以上来自于花瓣介导的侵染，而角果的侵染主要由于与被侵染茎叶的接触。如能阻止病原侵染花瓣或在花瓣中杀死病原菌，即能基本阻断菌核病侵染循环，从而提高油菜菌核病的防控水平。针对这个侵染循环，本实验室设计了一种技术路线，即利用花瓣作为生物反应器，在其中特异、高量、持续、稳定地表达抑菌物质，就地杀死病菌，达到阻止病害侵染循环、防治病害的目的。该生物反应器的关键元件是:1）特异、高效、持续表达的油菜花瓣启动子，2）高效的抑菌基因，3）表达产物的有效胞外运输和抗降解能力。本文的研究集中在抗菌肽筛选和元件的组装。主要结果如下。　　1、油菜高效抗菌肽的筛选。抗菌肽（Antimicrobial Peptides，AMPs）是一类具有抑菌活性的天然小分子蛋白，广泛存在于生物界，是机体非特异性免疫的重要组成部分，在体内外均具有抑菌活性。本研究首先通过生物信息学的手段在油菜全基因组范围内进行抗菌肽基因的预测和分析，初步筛选出40个与已知抗菌肽具有类似序列结构特征的候选基因。然后人工合成并纯化，再装入pET30a-EDDIE-GFP表达载体上，在大肠杆菌中表达。通过包涵体融合蛋白的体外复性和EDDIE的自我剪切，获得不附加任何多余氨基酸的抗菌肽产物。通过抑菌活性检测实验筛选出32个对细菌具有强抑菌活性的抗菌肽基因，24个对核盘菌具有较强的抑菌活性。　　2、一个新型油菜脯氨酸富集类抗菌肽的获得。脯氨酸富集类抗菌肽最早发现于昆虫和动物中，尚未在植物中发现这一类型的抗菌肽基因。本研究首次在植物中发现了脯氨酸富集类抗菌肽基因，其编码的35个氨基酸序列中含有13个脯氨酸，脯氨酸含量大于35％，我们将它命名为BnPRP1，BnPRP1与来源于猪的脯氨酸富集类抗菌肽SP-B同源性为40.5％，同时在油菜中发现四个同源性序列，在油菜亲本种白菜和甘蓝中各发现两个同源性序列。圆二色谱结果显示BnPRP1二级结构主要以无规卷曲为主，含有少量α-螺旋结构。抑菌活性检测实验发现BnPRP1具有较强抗细菌和抗真菌活性，对核盘菌具有较强的抑菌活性。qRT-PCR检测了BnPRP1基因表达是否受病原侵染的影响（诱导或抑制或不受影响）。结果显示BnPRP1基因的表达受病原侵染的影响。在核盘菌接种后48h，感病品种中表达量显著提高，而在抗病品种中呈现小幅的下降。这些结果表明BnPRP1基因可能在油菜菌核病防御反应中发挥了一定的作用。　　3、花瓣生物反应器初步组装。基于上述思路，首先利用35S启动子、前人已研究较为透彻的萝卜抗菌肽基因Rs以及文献报道的水稻α-淀粉酶信号肽αAmy3SP为元件，构建载体，转化拟南芥。结果表明所克隆的萝卜抗菌肽基因Rs和信号肽αAmy3SP基因大小正确，用信号肽+GFP的实验表明信号肽能将GFP准确定位到细胞间隙;转拟南芥实验结果表明，4个转基因纯系的Rs表达量均显著增加;抗病鉴定结果显示，转基因拟南芥对菌核病的抗性显著增加，同时目标基因的过表达不影响植株的正常生长与发育。接着以本实验室发现的高效、特异（基于转录组测序和GUS结果）的油菜花瓣启动子P76247、萝卜抗菌肽基因Rs以及信号肽αAmy3SP为基本元件，构建载体，转化拟南芥。结果表明，Rs在花中表达量最高（相对于Actin基因表达量），显著高于叶和茎，也显著高于35S驱动的该基因在花、叶和茎中的表达量。尽管花瓣的抑菌或抗病效果检测尚未完成，但基于其在花中的高表达和35S启动子驱动的转基因抗病性结果，可预期花瓣具有强的抑菌能力。本文的研究对利用基因工程技术提高作物对菌核病的抗性提供了新的思路。