不同工艺发酵的虾酱中细菌群落和品质特性的研究

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虾酱是一种传统的发酵水产品,具有独特的风味和良好的营养价值。传统虾酱的制作过程为自然发酵,微生物区系及其代谢活动复杂,不同地区来源的虾酱的品质和微生物多样性有一定差异。目前,传统虾酱生产工艺一般存在发酵时间长、含盐量高、品质不稳定等诸多问题。为了改进传统虾酱的生产工艺,本文首先对黄骅地区市售的传统虾酱的品质特性和细菌多样性进行了评估;然后,使用酶法辅助发酵制备虾酱,对其发酵过程中的品质特性和细菌群落演变进行了系统研究;之后,制备了低盐虾酱,并对其发酵过程中的品质特性、细菌群落及代谢组学的变化进行了系统研究;最后,对低盐虾酱产品的品质、营养和微生物安全性进行了全面的评估。本文主要研究结果如下:(1)评估了黄骅地区市售虾酱产品的品质特性和细菌群落。使用高通量测序(high-throughput sequencing,HTS)技术和高效液相色谱分别对细菌群落和生物胺含量进行分析,并对其它品质特性包括pH值、氨基酸态氮(amino acid nitrogen,AAN)、亚硝酸盐、丙二醛等进行了测定。细菌群落分析表明,在所有虾酱样品中,厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)是最主要的门;肠球菌科(Enterococcaceae),假单胞菌科(Pseudomonadaceae)和葡萄球菌科(Staphylococcaceae)是最主要的科;主要优势属是四联球菌属(Tetragenococcus),乳杆菌属(Lactobacillus)和盐厌氧菌属(Halanaerobium)。虾酱样品中的pH,AAN,丙二醛,亚硝酸盐和生物胺总含量范围分别是6.77~8.25、0.16~0.35 g/100 g,0.25~1.10 mg/kg,0.18~0.49 mg/kg 和 18.20~469.02 mg/kg,主要的生物胺种类是色胺、组胺和酪胺。四联球菌属和AAN、组胺及酪胺之间的相关性分别为0.71、0.62和0.67(R2)。研究结果为改善黄骅传统虾酱发酵工艺提供了理论依据。(2)研究了酶法辅助发酵虾酱的品质特性变化和细菌群落演变。运用HTS技术,分析了不同处理间虾酱的细菌群落组成;通过Spearman分析了虾酱发酵期间细菌群落与主要品质特性之间的相关性。结果显示,加入蛋白酶制剂的虾酱在发酵期间AAN和挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)含量均有所提高,缩短了发酵时间,但是也可能会导致品质的下降。加入酶制剂对生物胺并无明显影响。所有虾酱样品共获得313864条有效序列,1279个OTUs。加入酶制剂后明显影响虾酱的细菌群落组成,降低了细菌丰富度。在属水平上,对照组中黄杆菌属(Flavobacterium)为优势属,而加酶组中芽孢杆菌属(Bacillus)为优势属。加入蛋白酶制剂后,芽孢杆菌属增加,乳球菌属(Paracoccus)减少;芽孢杆菌属、黄杆菌属和乳球菌属是主要差异细菌,影响虾酱质量的品质特性。因此,外加蛋白酶制剂对虾酱发酵期间的细菌群落组成、丙二醛、TVB-N和AAN有重要影响,为改善加酶虾酱的生产工艺奠定了基础。(3)研究了低盐虾酱发酵过程中品质特性和细菌群落的动态变化。研究结果显示,在20℃和10℃两种发酵温度下,低盐虾酱中的优势门一直是厚壁菌门(Firmicutes),在属水平上,20℃下发酵的虾酱中嗜碱菌属(Alkalibacterium)和四联球菌属(Tetragenococcus)是优势属,10℃下发酵的虾酱中优势属是嗜碱菌属和葡萄球菌属(Staphylococcus),两组虾酱中嗜碱菌属、四联球菌属和立克次氏体(Rickettsia)含量差异极显著(P<0.01),低温发酵会导致嗜碱菌属的升高和四联球菌属的降低。20℃下发酵的低盐虾酱中TVB-N和生物胺含量均高于10℃下发酵的低盐虾酱,20℃下发酵的虾酱中TVB-N最高升至783.89 mg/100g,超出安全限量标准;不同温度下发酵的虾酱中pH和AAN无显著差异。因此,温度对低盐虾酱发酵过程中细菌多样性及品质特性有重要影响。(4)分析了低盐虾酱的代谢组学。采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术对低盐虾酱发酵过程中的代谢物进行监测;结合T检验和VIP分析等多元统计分析,筛选出差异代谢物;使用edclidean距离算法对两组低盐虾酱中差异细菌和差异代谢物的相关性进行分析。结果表明,正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型显示,不同温度下发酵的低盐虾酱之间的代谢物能够明显分离。两组低盐虾酱中共有44种主要代谢物,包括氨基酸类16种,脂肪酸类6种,胺类化合物2种,有机酸类8种,醇类3种,核苷酸类3种,其他类化合物6种。以P<0.05和VIP>1为筛选条件,得到30种差异代谢物,主要包括氨基酸类7种,酯类2种,嘌呤类2种,有机酸类8种,醇类2种和其他代谢物9种;其中,与对照组(20℃)相比,低温组(10℃)中L-丝氨酸、L-苏氨酸、黄嘌呤、次黄嘌呤和L-谷氨酰胺显著增加,乙酸橙花酯、樱黄素和褪黑素显著减少(P<0.01)。嗜碱菌属与L-苏氨酸和L-丝氨酸之间的相关性分别为0.93和0.92(R2),四联球菌属与甲氧基色胺、亚牛磺酸和L-苏氨酸之间的相关性分别为0.85、0.82和-0.67(R2)。(5)评价了低盐虾酱的质量、营养和微生物安全性。参照虾酱行业相关标准,对加盐量为10%,发酵温度为10℃,发酵时间为20周的低盐虾酱进行了全面的评估。结果表明,其pH、AAN、TVB-N和生物胺总量分别为8.04、0.30 g/100g、192.46 mg/100g和34.63 mg/kg,均在安全范围内;大肠菌群和副溶血性弧菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌没有检出;L-丝氨酸、L-苏氨酸和L-谷氨酰胺等氨基酸类含量较高。综合来看,低温发酵的低盐虾酱是一种安全且营养特性较好的虾酱产品。综上所述,本文对三种发酵工艺制备的虾酱的品质特性和细菌群落进行了比较系统的研究。黄骅传统虾酱中四联球菌属是主要的优势细菌,其和AAN、组胺及酪胺之间的相关性分别为0.71、0.62和0.67(R2)。中性蛋白酶制剂的加入会使虾酱中的芽孢杆菌属和TVB-N含量上升,可能对虾酱的品质造成影响。与常温(20℃)发酵的低盐虾酱相比,低温(10℃)发酵的低盐虾酱中四联球菌属、TVB-N、生物胺和酯类化合物含量下降,氨基酸类化合物含量上升。低温发酵的低盐虾酱是一种安全且营养特性较好的新型虾酱产品。这些研究结果为改善传统虾酱生产工艺提供了一定的理论依据。
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