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本研究旨在研究督脉电针联合神经营养素-3(Neurotrophin3, NT-3)+维甲酸(Retinoid acid, RA)预诱导的MSCs(Bone marrow mesenchymal stem cells, MSCs)移植治疗溴化乙锭(Ethidium bromide, EB)诱导的大鼠脊髓脱髓鞘损伤，通过督脉电针提高病灶的NT-3浓度，促使经预诱导表达酪氨酸激酶受体C (tyrosine kinasereceptor C, TrkC)基因的MSCs移植后能更多地分化为少突胶质前体样细胞和少突胶质样细胞，参与髓鞘结构的重建，改善脊髓的神经传导功能。从而为MSCs移植治疗MS的神经替代机制提供实验依据，为临床应用提供治疗策略。为求证上述研究设想，现将实验内容分以下2个部分。1体外NT-3联合维甲酸预诱导MSCs表达TrkC的研究目的：用NT-3+RA预诱导MSCs，增加TrkC mRNA的转录，并翻译为TrkC蛋白。方法：贴壁法培养及纯化MSCs。分为对照组、NT-3组、RA组和NT-3+RA组对MSCs诱导分化。在预诱导1d、3d后提取RNA，反转录为cDNA后进荧光定量PCR反应检测TrkC mRNA的转录。用琼脂糖凝胶水平电泳检测MSCs TrkCmRNA Real-time PCR后的产物，原位杂交技术检测预诱导1d的TrkC mRNA在MSCs内的表达。免疫荧光细胞化学染色技术和Western blot检测预诱导1d、3d、7d TrkC蛋白在MSCs的表达。结果：NT-3+RA共同诱导后1d后就可以观察到TrkC mRNA相对表达量(3.54±0.87)明显升高，高于同一时间点内的对照组(1.20±0.39)，RA组(2.07±0.45)及NT-3组(1.24±0.13)，P<0.05；而且也高于3d后的RA组(2.15±0.81)、NT-3组(1.75±0.57)及NT-3+RA组(2.43±0.43)，P<0.05。琼脂糖凝胶水平电泳可见229bp的TrkC mRNA cDNAReal-time PCR扩增产物存在。原位杂交技术进行检测，发现对照组、RA组、NT-3组及NT-3+RA组MSCs均检测到TrkC mRNA转录。然而免疫荧光细胞化学染色技术和Western blot检测未能发现TrkC蛋白在MSCs表达。结论：NT-3+RA预诱导24h后可以明显增加MSCs TrkC mRNA转录，然而未能发现TrkC蛋白在MSCs表达。2`督脉电针与NT-3和RA预诱导的MSCs移植联合治疗EB诱导的大鼠脊髓脱髓鞘损伤模型目`的：利用预诱导1d的MSCs移植到EB诱导的大鼠脊髓脱髓鞘损伤模型，并联合督脉电针治疗，提高病灶处的NT-3水平，促使移植的MSCs更多地分化为少突胶质前体样细胞和少突胶质样细胞，参与髓鞘结构的重建，改善脊髓的神经传导功能。方`法：贴壁法培养及纯化带绿色荧光蛋白MSCs，NT-3+RA预诱导1d。应用SD成年雌鼠，注射EB制备脱髓鞘模型。分为7组：Sham组、1天EB组和EA组，4天EB组和EA组，14天EB组和EA组，用ELISA试剂盒检测脱髓鞘脊髓组织的内源性NT-3水平。另取动物造模后随机分为6组：EB组、EA组、MSCs组、NR-MSCs组、NR-MSCs+EA组和NR-MSCs+NP组。造模电针3d后，在脊髓脱髓鞘部位移植预诱导的MSCs。其中EA组、NR-MSCs+EA组和NR-MSCs+NP组在细胞移植后第2d开始进行电针治疗，隔天1次，持续29d。并且从移植后1d开始，每隔1d进行平衡木评分。29d后进行运动诱发电位的检查，然后分别灌注取出脊髓组织固定进行冰冻切片，进行免疫组化分析，观察TrkC、髓鞘碱性蛋白（BMP）的表达，计算MSCs存活数，硫酸软骨素蛋白多糖（NG2）和成熟少突胶质细胞标志物(APC)的阳性分化率。及固定后进行半薄切片髓鞘计数、透射电镜观察及超薄切片免疫电镜观察MSCs的分化。结果：督脉电针治疗14d后，EA组的NT-3浓度明显高于EB组。MSCs组、NR-MSCs组、NR-MSCs+EA组和NR-MSCs+NP组的MSCs细胞存活数差异无统计学意义。MSCs移植到体内后能表达TrkC蛋白。NR-MSCs+EA组的NG2阳性率和APC阳性率明显升高，差异有统计学意义。在NR-MSCs+EA组和NR-MSCs+NP组可见GFP阳性细胞与MBP阳性标记和Hoechest33342标记的细胞核重合，在前者，还可以观察到MBP+GFP+Hoechest33342阳性标记的细胞包绕宿主的NF神经纤维。GFP免疫电镜法观察可见NR-MSCs+EA组脊髓脱髓鞘区内MSCs分化为少突胶质样细胞并形成髓鞘包绕轴突。髓鞘计数情况，NR-MSCs+EA组溃变髓鞘明显减少，新生髓鞘和正常髓鞘明显增多，差异有统计学意义。皮质运动诱发电位，NR-MSCs+EA组潜伏服期明显缩短，峰峰值明显增加，差异有统计学意义。6组动物平衡木评分没有差异。结论：督脉电针治疗14d能明显提高EB脱髓鞘大鼠模型脊髓内的NT-3浓度。督脉电针与NT-3+RA预诱导的MSCs移植联合治疗EB脱髓鞘大鼠模型对MSCs存活没有明显影响，但能明显促进MSCs更多的向少突胶质前体样细胞及少突胶质样细胞分化，并形成髓鞘包绕轴突。联合治疗还能减少髓鞘溃变，促进更多的新生髓鞘形成，保留更多的正常髓鞘，改善脊髓神经传导功能，但对EB脱髓鞘大鼠的运动功能疗效不明显。