Fechtner综合征是一种常染色体显性遗传的巨大血小病,其临床表现为血小板巨大,血小板减少和中性粒细胞包涵体,肾小球肾炎和/或听力丧失、白内障。非肌性肌球蛋白重链9基因(MYH9)基因突变是导致Fechtner综合征发病的分子机制。MYH9编码非肌性肌球蛋白重链ⅡA(NMMHC-ⅡA),非肌性肌球蛋白ⅡA表达于多种细胞和组织,它参与了多种细胞的功能包括细胞质分裂、细胞运动和维持细胞的形态。大多数细胞都可表达非肌性肌球蛋白重链的三种亚型ⅡA、ⅡB和ⅡC,如肾脏、耳蜗和晶状体,而中性粒细胞和血小板只表达NMMHC-ⅡA。至今为止,对Fechtner综合征的发病机制及非肌性肌球蛋白ⅡA的功能了解较少。我们诊断了国内首例遗传性Fechtner综合征家系并对其进行了临床特征和分子诊断、肾脏病变的机理和非肌性肌球蛋白ⅡA功能等方面的研究。上述研究对深入认识MYH9综合征的发病机理和非肌性肌球蛋白ⅡA的功能有重要意义。目的:对1例遗传性Fechtner综合征家系进行临床特征和分子诊断、肾脏病变的机理和非肌性肌球蛋白ⅡA功能等方面的研究。以期初步阐明Fechtner综合征发病的分子机制。方法:1.外周血片观察血小板和中性粒细胞形态,提取Fechtner综合征家系先证者及其家系成员外周血基因组DNA,PCR法扩增其MYH9基因所有40个外显子和侧翼序列,DNA序列分析确定MYH9基因异常。2.透射电镜观察Fechtner综合征先证者血小板和中性粒细胞的超微结构。3.间接免疫荧光方法结合DAPI复染细胞核的技术观察中性粒细胞包涵体的形态。4.HE染色、免疫组化、免疫荧光和电镜对Fechtner综合征患者的肾脏病变进行了研究。5.半定量Western-Blot检测中性粒细胞非肌性肌球蛋白ⅡA的表达。以人胚肾细胞(HEK-293)为研究对象对ⅡA、ⅡB之间的相互作用进行了探讨。RT-PCR法检测HEK-293细胞中非肌性肌球蛋白ⅡA、ⅡB的表达,并对其进行了免疫共沉淀的研究。结果:1.外周血片可见巨大血小板,其中中等大(4-7μm)血小板占血小板的53%,巨大血小板(＞7μm)占9%。中性粒细胞胞浆中出现小的、灰蓝色的包涵体。约74%的中性粒细胞可见到中性粒细胞包涵体。PCR产物多次直接测序,均在先证者的MYH9基因外显子40中发现第5981位核苷酸由C→T杂合性突变,使第1933位密码子(CGA,编码Arg)突变为终止密码TGA。2.先证者的血小板体积大,致密颗粒、线粒体等颗粒的数量未见异常。开放管道系统基本正常。中性粒细胞形态大体正常,但胞浆中存在小的包涵体,不同于其它颗粒或细胞器并且周围无膜分隔。放大电镜倍数后发现包涵体内为致密结构,包含一些粗面内质网并且无颗粒。3.正常对照中性粒细胞胞浆中非肌性肌球蛋白ⅡA呈分散均质性分布,无绿色荧光聚集现象。而先证者及家系其他患者中性粒细胞胞浆中均可见明显团块状、半月形的绿色荧光聚集,其大小、位置与瑞氏染色的中性粒细胞包涵体相同。4.患者肾脏标本HE染色发现在12个肾小球中有6个已明显硬化,其余肾小球的部分节段系膜细胞轻.中度增生伴基质增多,并有少数节段与球囊壁粘连。间质炎症细胞小灶性分布,主要围绕在硬化肾小球周围,少数肾小管有蛋白管型。局灶性肾小管上皮细胞肿胀,颗粒变性。肾脏免疫组化观察到非肌性肌球蛋白ⅡA主要位于肾小球脏层上皮细胞(足细胞)和远曲小管上皮,微弱表达于近曲小管刷状缘。与正常肾组织相比,Fechmer综合征患者非肌性肌球蛋白HA在肾小球足细胞的表达减少,非肌性肌球蛋白ⅡA在远曲小管的表达与正常无差别。肾脏免疫荧光提示患者非肌性肌球蛋白ⅡA在肾小球的绿色荧光强度明显高于正常人,通过足细胞特异性抗体染色分析,非肌性肌球蛋白ⅡA主要沉积在肾小球足细胞,并且系膜细胞和系膜基质轻度增生。患者肾脏标本电镜显示2个肾小球,其中1个已发生硬化,另1个为节段性硬化。肾小球系膜区有中度电子致密物沉积,伴有局部系膜细胞增生及基质增多。足突部分融合伴少量微绒毛形成。5.免疫印迹显示先证者中性粒细胞ⅡA/β-actin比值为(0.35±0.12)较正常对照中性粒细胞ⅡA/β-actin(0.874±0.18)相比明显减少,相当于正常中性粒细胞的39%(均值39%,范围:33%-44%),有统计学意义(P＜0.01)。非肌性肌球蛋白ⅡA、非肌性肌球蛋白ⅡB在HEK-293细胞中均有较高的表达,特异性引物扩增ⅡA的片段大小为331bp,ⅡB的片段大小为492bp。HEK-293细胞裂解液用特异性的非肌性肌球蛋白ⅡA抗体进行免疫共沉淀分析,发现非肌性肌球蛋白ⅡA和非肌性肌球蛋白ⅡB均有表达。阴性对照两者均无表达。结论:1.国内首次报道Fechtner综合征家系。2.国际上首次报道R1933X突变位点同时出现了。肾脏病变,证实过去命名的May-Hegglin异常、Sebastian综合征、Fechmer综合征和Epstein综合征是同一种疾病的不同表现。3.建立了诊断MYH9综合征的快速简便的免疫荧光方法,较以往的免疫荧光方法相比,更清晰和方便地显示中性粒细胞核和包涵体的结构。4.国际上首次运用HE染色、免疫组化、免疫荧光和电镜对R1933X基因突变的Fechtner综合征患者的肾脏病变进行了研究,并提出突变的ⅡA间接影响了足细胞SD分子的功能抑或是影响了足细胞细胞骨架导致了肾脏病变的发生。5国内首次对非肌性肌球蛋白ⅡA的功能进行了初步研究,提出负显性效应导致了中性粒细胞包涵体的产生。ⅡA和ⅡB有明显的相互用,提示ⅡB至少是部分补偿了Fechtner综合征突变的ⅡA蛋白的作用并延缓了组织的功能障碍。