犬源贾第虫基因分型及Real-time PCR检测方法的建立

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jie_er
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蓝氏贾第虫是一种重要的人兽共患寄生原虫,其分子特性较为复杂,至少包含7个(A~G)有效集聚体。基于传统的分类鉴定方法无法准确鉴定贾第虫种类及其基因型,分子生物学方法是揭示贾第虫病分子流行病学及其人兽互传机制的重要手段。本论文对广东犬粪中发现的贾第虫包囊进行了形态学观察和分子鉴定,并首次建立了SYBR Green I real-time PCR检测方法,在此基础上利用高分辨率熔解曲线分析技术(HRM)建立了贾第虫快速基因分型方法。  本研究首先对佛山分离的两株犬源贾第虫(GD1和GD2)tpi基因进行了巢氏PCR扩增、克隆和测序,扩增产物测序后用Blast和DNA Star软件进行同源性和遗传关系分析。结果GD1的tpi基因与L02120的同源性为100%,属于人畜共患的AI型;GD2与DQ220289的同源性为99.1%,为犬的D型。  为了建立人畜共患贾第虫定性定量的检测方法,针对犬源贾第虫16S rRNA基因片段设计一对引物,将构建的重组质粒作为阳性对照,建立了贾第虫DNA的SYBRGreenI real-time PCR检测方法。结果显示,特异性产物Tm值为94.20℃,最低可检测到3.39 copies/μL酌阳性质粒。标准曲线的相关系数为0.99。与其他常见原虫隐孢子虫、犬等孢球虫、柔嫩艾美尔球虫均不发生交叉反应,重复性变异系数小于3%。该检测方法具有较好的特异性和敏感性,为贾第虫病的临床检测和流行病学调查提供了新的技术手段。  为了建立贾第虫快速基因分型方法,本研究针对犬源贾第虫tpi基因设计一对引物,分别以编号为A型(WB)和B型(GS)贾第虫基因组DNA为模板进行PCR扩增、克隆、质粒抽提及测序,结果显示WB和GS分别为蓝氏贾第虫AI型和BIV型。根据HRM引物设计原则,设计一对小引物,对11份犬贾第虫DNA进行基因分型,结果显示阳性标准品WB和GS的高分辨率熔解曲线的TM值分别为84.45℃~84.55℃和82.87℃~82.90℃。待测贾第虫DNA经系统软件(Rotor-Gene Q SeriesSoftware2.0.2)分析显示:9份为AI型,2份为BIV型。将待测样品直接测序,所得序列与GenBank上登录的已知序列进行比对,比对结果与HRM的分型结果完全一致。结果表明HRM技术可以对人畜共患的蓝氏贾第虫进行快速的基因分型。
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