论文部分内容阅读
本文在已建立的人参和三七不定根培养体系的基础上,针对培养物中皂苷含量偏低以及皂苷合成下游途径不清楚等科学问题,进行了诱导子的作用研究和基因UGTPgX的功能验证。本文首先考察了米曲霉、黄曲霉、黑曲霉的菌体粗提物以及菌体发酵液对人参不定根生长和人参皂苷积累的影响。发现浓度为200 mg·L-1黑曲霉菌体粗提物可以显著提高不定根中人参皂苷的含量(29.90±4.67mg·g-1),是对照组的3.52倍。为了研究黑曲霉菌体粗提物中起诱导作用的主要成分,考察了菌体蛋白和菌体多糖对人参皂苷含量的影响,结果显示当菌体蛋白浓度为100 mg·L-1时,人参皂苷的含量达到最大值为20.37±0.98 mg·g-1,是空白组的2.83倍。因此我们又考察了不同分子蛋白片段对人参皂苷含量的影响,发现150 mg·L-1大于30 kDa的蛋白片段使人参皂苷的含量达到最大18.78±0.55 mg·g-1,为空白组的1.90倍。随后对人参不定根中人参皂苷种类以及诱导机制进行了考察,发现诱导子可以增加与抗性反应相关的信号分子如细胞表面磷脂酶PLA2活性以及Ca2+、SA、JA、NO和ABA等信号分子的积累、也可以提高抗性基因PR10、PAL表达量以及人参皂苷合成过程中关键基因GPS、FPS、SS、SE、DS、CYP716A47、CYP716A53v2、UGT74AE2、UGT94Q2、UGTPg100和UGTPg1的表达量,并且能够改变不定根中人参皂苷的种类。建立了三七不定根培养体系并进行了诱导子的研究。为了提高三七不定根中活性成分的含量,加入诱导子茉莉酸（JA）、二氢茉莉酮酸甲酯（MDJ）,结果显示,当JA的浓度为5mg·L-1时,皂苷和多糖含量达到最大(71.93±6.19mg·g-1与140.20±1.50 mg·g-1),分别为空白组的8.46倍与1.60倍。经LC-MS分析显示,与对照组相比,有六种新皂苷出现。随后又对其诱导机制进行了考察,发现诱导子是通过植物细胞中的过氧化酶体系来增强自身免疫,从而诱导皂苷合成途径中的功能基因发生变化来实现皂苷含量的增加。此外,对人参皂苷合成途径中功能基因UGTPgX进行了功能验证,发现其可转化Rd、Rh1分别为Rb1、Rg1。以上研究为人参和三七不定根的大规模培养以及皂苷产业化提供了一定的理论和技术支持。