研究内容:肿瘤发生转移是导致恶性肿瘤患者死亡的主要原因。近年来的研究发现,器官特异性表达的趋化因子及癌细胞表达的受体介导的趋化运动在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥着重要的作用。许多组织和器官可以分泌一系列趋化因子如表皮生长因子（EGF）和CXCL12,研究发现它们通过表皮生长因子受体（EGFR）和CXCR4可以有效地介导癌细胞的趋化运动,而EGF更是一个有效的乳腺癌细胞趋化运动的趋化因子。尽管癌细胞趋化运动的复杂分子机制至今还不清楚,然而近年来一些研究发现,在所有PKC亚型中,PKCζ是EGFR和CXCR4介导的乳腺癌和非小细胞肺癌细胞趋化信号途径重要的汇聚点,常被激活或过表达。我们课题组的前期工作也证实了利用siRNA技术降低细胞中PKCζ的表达,能够明显抑制癌细胞在体内的扩散和转移,显示PKCζ可以作为一个抗癌药物靶标。基于此,本研究应用美国Invitrogen公司的药物筛选试剂盒针对小分子化合物库筛选PKCζ激酶特异性的抑制剂,并探讨抑制剂对癌细胞趋化运动的影响,以揭示肿瘤发生转移的分子机制,以便进一步寻找更有效的肿瘤转移抑制剂。方法:第一部分:应用美国药物筛选试剂盒Z’-LYTE^TM KINASE Kit,针对含有180种小分子化合物的化合物库筛选PKCζ激酶特异性的抑制剂。第二部分:以乳腺癌细胞MDA-MB-231为研究对象,采用MTT实验检测筛选出的小分子化合物的细胞毒性;通过细胞趋化实验和伤口愈合实验来检测它对MDA-MB-231细胞迁移的影响;通过肌动蛋白聚合实验、粘附实验和cofilin蛋白的western blotting实验探讨其对抑制癌细胞趋化运动和迁移的分子机制。结果:第一部分:通过试剂盒筛选得到PKCζ和PKCα的最佳激酶浓度分别为125、9ng/ml;.小分子化合物PKCzI257.3(分子式:C₁₅H₁₉N₃O)可以特异性地显著抑制PKCζ激酶的活性(IC₅₀=28μM),对PKCα没有明显的抑制作用(IC₅₀=200μM);商品化的PKC抑制剂G_o|¨6850既可以抑制PKCζ激酶的活性(IC₅₀=4.8μM),又可以抑制PKCα的活性(IC₅₀=0.04μM)。第二部分:通过MTT实验检测,结果发现PKCzI257.3对乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖没有明显的影响;趋化和伤口愈合实验检测得到PKCzI257.3显著抑制了EGF诱导的乳腺癌细胞的趋化运动和迁移;通过细胞粘附实验发现PKCzI257.3显著抑制了癌细胞对纤维连接蛋白的粘附;通过F-actin聚合实验和Westernblotting实验证实了PKCzI257.3能够抑制cofilin的活化和肌动蛋白的聚合。结论:1.小分子化合物PKCzI257.3可以特异性抑制PKCζ激酶的活性,并且没有明显的细胞毒性;一系列细胞功能实验显示:PKCzI257.3可以有效地抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的趋化运动和迁移、粘附,其分子机制可能是PKCzI257.3通过阻断EGF诱导的cofilin活化和肌动蛋白的聚合从而抑制了癌细胞的运动。2.初步的分析显示了PKCzI257.3是一个PKCζ激酶特异性抑制剂,有望成为治疗癌症转移的一种靶向性药物。