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乳腺癌是女性中常见的一种癌症,近年来我国乳腺癌的发生率和死亡率呈上升趋势。乳腺癌的发生发展受到遗传、激素水平、生活习惯和环境等多种因素的影响,其中遗传背景、年龄和性别是乳腺癌发生的高危因素,约5-10%的乳腺癌是遗传性乳腺癌。与乳腺癌发生高度相关的易感基因主要是BRCA1和BRCA2基因,约15%的家族性乳腺癌与BRCA1/2基因突变相关。BRCA1/2基因是抑癌基因,能够维持双链DNA的稳定性,BRCA1/2编码区突变会升高患乳腺癌的风险。基于多重PCR的靶向测序技术是一种高效、经济、准确的测序方案,利用该技术对疾病易感基因的突变检测已经得到越来越广泛的应用。基于转座酶的建库试剂盒具有高效、省时、起始DNA需求量低等优势。本论文利用多重PCR靶向富集BRCA1/2外显子并结合基于转座酶的建库试剂盒建库,利用二代测序平台Illumina Hiseq 2500系统对该DNA文库进行突变位点检测并对其测序结果进行应用分析,主要研究内容分为以下三个部分:1、设计靶向富集BRCA1/2全外显子的多重PCR引物及多重PCR反应条件优化。研究共设计了 58对引物覆盖BRCA1/2外显子和剪接位点区域,其中BRCA1引物25对和BRCA2引物33对,分别覆盖基因长度17763 bp和24383 bp,扩增子长度在400-1500 bp 之间。BRCA1/2 多重 PCR 反应总体系均为 25 μL,包括 2×Premix Ex Taq HS(TaKaRa)12.5μL,模板DNA5ng,BRCA1混合引物(每条1 μM)1 μL或BRCA2混合引物(每条 1 μM)4μL。反应条件:95℃ 预变性 2 min,94℃ 变性 30 s,56℃ 退火 1 min,72℃延伸2 min,循环参数为22次,72℃终延伸10 min。扩增后发现,BRCA1产物浓度高于BRCA2产物。2、NGS测序文库制备及生物信息学分析。为了确定最优的NGS文库制备方法,利用多重PCR和基于转座酶建库的方法制备了四组不同的比对文库:1)BRCA1 PCR文库,2)BRCA2 PCR文库,3)BRCA1/2 PCR产物混合文库及4)BRCA1/2引物混合PCR文库(BRCA2:BRCA1=4:1,混合引物总量2 pmol)。NGS测序及生物信息学分析结果显示,这4种基于多重PCR靶向测序的方法,在1或2个多重PCR反应中可以捕获BRCA1和BRCA2所有外显子。这4种文库的30×平均覆盖度分别为100%、100%、99.94%和100%。在这4种文库中,BRCA2外显子平均测序深度和捕获效率均高于BRCA1外显子。应用多重PCR靶向测序的方法对21例健康外周血全血样本和2例乳腺癌肿瘤组织样本的BRCA1/2外显子进行测序,共检出25个SNPs位点(其中1个BRCA1 c.T5102A突变未被报道过)。未发现小片段的插入和缺失。4种方法检出的SNPs位点经Sanger测序验证为真。这种基于多重PCR靶向测序的方法能够用于临床样本BRCA1/2突变检测。3、应用基于多重PCR靶向测序的方法检测乳腺癌样本BRCA1和BRCA2基因全外显子区变异。提取基因组DNA,应用方法3)和4)制备12个乳腺癌外周血白细胞样本的NGS文库,检测BRCA1和BRCA2基因全外显子区突变。高通量测序结果显示BRCA1/2所有外显子均被捕获,共检出24个突变,其中有1例BRCA1致病突变rs80357303,该易感突变被报道会增加乳腺癌的发病风险。结合21个健康样本对照分析,我们共检出 30 个 SNPs,其中 7 个 SNPs 包括 rs28897689、rs55919657、rs118093942、rs11571707 和 rs80359065、rs80357303(致病突变)和未报道的 BRCA1c.T5102A 突变仅出现在乳腺癌样本中,3个SNPs包括rs1800062、rs80359785和rs80357127仅出现在健康样本中。SNPs致病性预测结果显示,未报道的BRCA1c.T5102A突变为良性,而rs80359065很可能是导致BRCA2蛋白有害突变。Sanger测序验证进一步证实这种基于多重PCR靶向测序的方法在检测BRCA1/2全外显子区变异方面具有高的应用潜力。