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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)感染导致的一种急性传染病。该病能引起怀孕母猪流产、早产、死胎、木乃伊胎,仔猪与育肥猪则表现为明显的呼吸道症状,仔猪断奶前死亡率增高。目前PRRS已经遍及全球主要养猪的国家和地区,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。PRRSV通过与细胞膜表面的特异性受体结合,利用细胞内吞作用感染易感细胞。现已报道的存在于Marc-145细胞上的PRRSV的受体有CD163和波形蛋白。CD163属于富含半胱氨酸超家族的清道夫受体蛋白,起协助PRRSV脱衣壳和将病毒基因组RNA释放到胞浆的作用。波形蛋白与其它中间细丝蛋白组成的多聚体可能参与PRRSV在细胞内的复制和转移。2008年,Zhou等用针对PRRSV GP5蛋白抗体的抗独特型抗体(Mab2-5G2)通过免疫共沉淀的方法从PAM和MA-104胞中提取出一个分子量约230KD的可溶性蛋白,该蛋白为非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A (Nonmuscle myosin heavy chain Ⅱ-A, NMHCⅡ-A)。非肌肉肌球蛋白Ⅱ型(NMⅡ)广泛存在于生物细胞中,在整个细胞周期,包括细胞迁移、胞质分裂、细胞吸附和细胞形态变化等过程中发挥重要作用。最新的研究.结果证明NMHC Ⅱ-A作为Ⅰ型单纯疱疹病毒进入易感细胞的功能性受体。本实验室前期研究证实NMHC Ⅱ-A蛋白的羧基端对PRRSV感染Marc-145细胞有阻断作用。为进一步验证NMHC Ⅱ-A在PRRSV感染Marc-145细胞中的作用,本研究以NMHCⅡ-A蛋白羧基端为研究对象,探究其与单克隆抗独特型抗体Mab2-5G2的结合位点及其在PRRSV感染Marc-145细胞中的作用,进行了以下实验：第一：NMHC Ⅱ-A与Mab2-5G2结合位点的鉴定及各蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞抑制作用的验证。首先对NMHC Ⅱ-A羧基端大小为310个氨基酸的蛋白(命名为PRA)进行分段表达和部分氨基酸的缺失表达,经I-ELISA和Western blot鉴定NMHCⅡ-A与Mab2-5G2的结合域为aa1677-1713。通过PRA蛋白的进一步分段表达和氨基酸的定点突变确定aa1678, aa1682和aa1700为NMHC Ⅱ-A与Mab2-5G2的结合位点。在活细胞工作站实时观察各蛋白对细胞周期无影响的前提下,通过病毒中和实验(Virus Neutralization Test, VNT)和荧光聚焦中和实验(Fluorescence Focus Neutralization, FFN)验证了各蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制作用,荧光定量PCR检测细胞内NMHC Ⅱ-A和CD163mRNA转录水平和Western blot检测细胞内NMHC Ⅱ-A和CD163蛋白表达水平。结果显示PRA蛋白及包含结合位点的蛋白有明显的抑制作用,而包含一个或不包含结合位点的蛋白抑制作用明显降低,并且蛋白对细胞内NMHC Ⅱ-A和CD163mRNA转录水平和蛋白表达水平无影响。证明NMHC Ⅱ-A与Mab2-5G2的结合位点在PRRSV感染Marc-145细胞中发挥作用。第二：PRA蛋白的真核表达及对PRRSV感染的抑制作用。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达并纯化得到天然构象的PRA蛋白。PRA蛋白与Marc-145细胞特异性结合,将PRRSV的感染延迟24h并且感染96h时其CPE明显弱于对照细胞。在PRRSV感染24h时,PRA蛋白能使其感染效率降低60%。但真核表达的PRA蛋白不能完全抑制PRRSV的感染,推测其他相关因素,如与PRRSV细胞受体的相互作用相关。第三：鉴定PRA蛋白与Marc-145细胞内其它受体的相互作用。免疫共沉淀验证PRA蛋白与Marc-145细胞内NMHC Ⅱ-A和CD163相互作用,并且PRA的四段互不重叠的分段蛋白都可与NMHC Ⅱ-A和CD163相互作用。结果充分证明NMHC Ⅱ-A与CD163特异性结合。实验结果证明NMHC Ⅱ-A羧基端在PRRSV感染Marc-145细胞过程中的重要作用,这为进一步研究PRRSV感染细胞的分子机制提供了一定的依据,也为进一步探求PRRS的防控提供了新的思路。