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根结线虫(Meloidogyne spp.)是植物根系的一类固定内寄生线虫,给世界农业生产造成了巨大的经济损失。根结线虫2龄幼虫侵入根系后,在根部建立固定的取食位点获取营养,完成其寄生生活史。在寄生过程中,根结线虫分泌大量的效应分子,通过口针注入寄主细胞内,帮助其侵入寄主根系、抑制寄主的防卫反应及成功建立取食位点等。针对课题组之前报道的南方根结线虫(M.incognita)分支酸变位酶(chorismate mutase,CM)基因Mi-cm-1 和Mi-cm-3 和毒液过敏原蛋白(venom allergen-like protein,VAP)基因Mi-vap-2,本论文对它们在南方根结线虫寄生过程中的作用机理或功能进行了研究。主要结果如下:1.Mi-cm-和Mi-cm-3编码蛋白具有分支酸变位酶活性且与病原物致病力相关为明确南方根结线虫效应分子Mi-CM-3在生物体内是否具有分支酸变位酶活性,分别利用非致病大肠杆菌和植物病原菌水稻黄单胞菌开展了cm缺失突变体功能回补测定,结果显示,Mi-CM-3与已知具有分支酸变位酶活性的Mi-CM-1 一样,能使大肠杆菌cm缺失突变体菌株JP2261在缺少苯丙氨酸的M9培养基上恢复生长能力;水稻黄单胞菌菌株PX099A的分泌型CM缺失突变体对水稻的致病力显著低于野生型菌株,诱导烟草过敏反应和抗病相关基因表达的能力增强;而回补了Mi-cm-和Mi-cm-3的PX099A回补子菌株对水稻的致病力均明显增强,激发烟草过敏反应和抗病相关基因表达的能力减弱。表明Mi-CM-1和Mi-CM-3都在生物体内具有分支酸变位酶的活性,且与病原物致病力相关。2.Mi-cm-1和Mi-cm-3分别在线虫的寄生初期和取食位点的建立或维持中发挥作用对基因Mi-cm-1和Mi-cm-3在南方根结线虫不同侵染阶段的发育表达模式进行RT-qPCR分析,结果显示,Mi-cm-1在侵染早期的虫体内大量表达,而Mi-cm-3在建立取食位点之后虫体内表达较高。采用间苯二酚刺激2龄幼虫吞咽和双链RNA(dsRNA)浸泡处理进行离体RNAi研究,dsRNA浸泡处理24 h后,RT-qPCR检测发现,处理后南方根结线虫2龄幼虫的Mi-cm-1和Mi-cm-3转录水平都明显降低,但只有Mi-cm-1 dsRNA浸泡处理后的2龄幼虫侵染本氏烟草的能力显著下降,而Mi-cm-3 dsRNA浸泡处理的2龄幼虫侵染烟草的能力,与对照无显著差异。建立了烟草脆裂病毒(TRV)介导的Mi-cm-1和Mi-cw-3沉默体系,接种2龄幼虫至TRV烟草株系14天后,RT-qPCR检测发现,Mi-cm-1和Mi-cm-3基因在线虫体内的表达水平降低;8周后统计发现,与对照烟草株系相比,在TRV::cm-3烟草株系上产生的根结数和雌虫数显著降低,而在TRV::cm-1烟草株系上没有表现显著差异。以上结果表明Mi-cm-1在线虫寄生的初期有重要功能,而Mi-cm-3可能在线虫建立或维持取食位点过程中发挥功能。3.过表达Mi-cm-1和Mi-cm-3抑制烟草根系的生长发育并提高对线虫的感病性为明确南方根结线虫分支酸变位酶Mi-CM-1和Mi-CM-3对烟草根系的生长发育及线虫自身侵入的影响,分别构建了植物表达载体pBI121-cm-1和pBI121-cm-3,利用农杆菌介导转化本氏烟草,获得了过表达Mi-cm-1和Mi-cm-3的转基因烟草植株。过表达Mi-cm-1和Mi-cm-3能够抑制烟草根系的生长发育,呈现主根发育缓慢的表型。接种2龄幼虫后,过表达Mi-cm-1和Mi-cm-3烟草植株根系上产生的根结数及雌虫数均明显多于对照。表明分支酸变位酶Mi-CM-1和Mi-CM-3能影响烟草的正常生长发育,并促进南方根结线虫的侵染能力。4.Mi-CM-1和Mi-CM-3通过抑制水杨酸的积累影响烟草抗病性利用农杆菌介导的瞬时表达测定了 Mi-CM-1和Mi-CM-3对本氏烟草抗病性以及flg22诱导烟草叶片的PTI相关基因转录的影响。RT-qPCR检测显示,Mi-CM-1和Mi-CM-3的瞬时表达对flg22诱导的烟草叶片PTI相关基因Pti5、Grans2和Acre31转录水平没有影响,用鲁米诺法测定烟草叶片的活性氧爆发,发现没有产生变化。烟草叶片瞬时表达Mi-cm-1和Mi-cm-3后接种水稻黄单胞菌PX099A,高效液相色谱(HPLC)检测显示,Mi-CM-1和Mi-CM-3能减少PX099A激发的烟草叶片SA积累,同时RT-qPCR检测证实Mi-CM-1和Mi-CM-3均能抑制PX099A激发的烟草抗病相关基因PR1和PAL的转录。表明Mi-CM-1和Mi-CM-3能通过干扰水杨酸的合成来抑制植物的抗病性。5.TRV介导南方根结线虫Mi-VAP-2转录水平上调并促进线虫的侵染利用TRV介导的RNAi技术研究了类毒液过敏原蛋白基因Mi-vap-2在南方根结线虫寄生过程中的作用。结果显示,在TRV::vap-2烟草株系根部接种7 d的线虫Mi-vap-2转录水平,相比对照明显上调,接种8周后形成雌虫数量及其生长发育并无明显改变。阳性对照TRV::16D10烟草株系根部接种7 d的线虫Mi16D10转录水平下调,同时完成寄生的线虫数量明显减少。收集TRV::vap-2烟草株系根部的子代2龄幼虫,RT-qPCR检测发现Mi-vap-2转录水平显著高于对照,ELISA结果也显示Mi-vap-2编码蛋白水平相比对照显著上调。将子代2龄幼虫接种野生型烟草,Mi-vap-2转录上调后的线虫在烟草根部形成的根结数和雌虫数,分别增加了76.2%和84.6%。Mi-vap-2转录的上调和蛋白表达的增加,促进了南方根结线虫的侵染,表明该基因可能在线虫寄生早期发挥着重要的作用。综上所述,分支酸变位酶和类毒液过敏原蛋白均在南方根结线虫寄生过程中发挥着重要的功能;Mi-CM-1主要在线虫侵染早期发挥功能,Mi-CM-3主要在线虫取食位点的形成和维持阶段具有功能,二者都能干扰寄主水杨酸的合成,抑制寄主的抗病反应;Mi-VAP-2在线虫的侵染早期发挥作用,且有助于线虫的侵染力增强。