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成纤维细胞生长因子21（Fibroblast growth factor 21,FGF21）是一种不依赖胰岛素信号通路安全有效的保护糖代谢稳态的细胞生长因子。对于提高机体胰岛素敏感度、降低机体胰高血糖素的水平、减少脂肪降低体重等具有显著的作用。近些年研究结果显示,FGF21有望成为治疗胰岛素抵抗的2型糖尿病和肥胖症的理想药物。枯草芽孢杆（Bacillus subtilis）是经美国FDA认证的一种公认安全（Generally recognized as safe,GRAS）的革兰氏阳性细菌,无内毒素产生,是表达重组蛋白常用的宿主之一。枯草芽孢杆菌具有完善的蛋白分泌途径,因此目的蛋白可以直接分泌到培养基中,有利于目的蛋白的大量积累和后期纯化工艺。枯草芽孢杆菌表达来源于真核细胞的异源蛋白时,存在蛋白可溶性差,包涵体多等问题,限制了其作为FGF21等人源药物蛋白细胞合成工厂的应用潜力。因此,我们期望通过构建并优化枯草芽孢杆菌表达分泌系统,实现重组人源FGF21（rhFGF21）蛋白在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达。枯草芽孢杆菌表达分泌系统的优化策略包括启动子的优化、Mini-cistron表达盒的引入、折叠酶的优化、分子伴侣过表达、胞外蛋白酶的敲除、信号肽的筛选以及转运蛋白过表达等方面,主要研究结果列举如下:1.通过筛选强启动子元件来提高目的蛋白rhFGF21在枯草芽孢杆菌中的表达水平。分别筛选了两种高表达强度的启动子:组成型启动子PHpaII和麦芽糖诱导型启动子PmalA,构建相应的rhFGF21表达载体pMA5F和pMATEF。通过表达结果的分析,rhFGF21蛋白能够在枯草芽孢杆菌中成功表达,同时确定麦芽糖诱导型启动子PmalA更有助于目的蛋白的表达,但表达水平较低,表明除启动子强度外还存在限制表达水平的瓶颈因素。2.通过在rhFGF21基因上游引入Mini-cistron表达盒,降低mRNA二级结构的稳定性来招募更多的核糖体,从而在翻译水平上提高rhFGF21的表达。通过对七种不同Mini-cistron表达盒重组菌株的摇瓶发酵和SDS-PAGE分析,最后确定Mini-cistron5（GsiB）可以显著提高目的蛋白的表达水平。3.由于rhFGF21蛋白内部含有一个二硫键,我们分别过表达了与二硫键相关的折叠酶DsbA和弱化了不利于二硫键形成的硫氧还蛋白TrxA的重组菌株来提高目的蛋白的可溶性,通过摇瓶发酵分析,TrxA的弱化有提高可溶性表达量的趋势。4.我们分别将不同的分子伴侣整合到枯草芽孢杆菌基因组上,提高相应分子伴侣的表达水平,从而辅助目的蛋白的翻译后折叠过程。结果表明分子伴侣DnaK的过表达能够显著提高rhFGF21蛋白在枯草芽孢杆菌中的可溶性表达量。5.在rhFGF21基因上分别引入点突变L98R、P171A、P171G来提高蛋白可溶性和稳定性,超声破碎后的结果显示L98R的位点突变使目的蛋白的包涵体水平小幅度降低。6.由于分泌至胞外的异源蛋白容易被蛋白酶降解,从而导致目的蛋白的分泌量降低。我们在自然缺失胞外蛋白酶AprE和NprE的枯草芽孢杆菌1A751的基础上,将剩余的六个胞外蛋白酶Bpr,Epr,Vpr,NprB,Mpr,WprA敲除来提高目的蛋白的分泌量。结果显示未敲除胞外蛋白酶的菌株中rhFGF1蛋白无法在胞外积累,而蛋白酶敲除菌株能够成功实现rhFGF21成熟蛋白的分泌。7.通过筛选Sec及Tat分泌途径中12种不同的信号肽来进一步提高rhFGF21蛋白的分泌,最后确定信号肽SPdacB更有助于目的蛋白分泌。8.为进一步提高rhFGF21蛋白的分泌水平,我们构建了不同的转运蛋白单基因/组合基因过表达菌株,通过摇瓶发酵分析转运蛋白SecY和SecYEG对提高rhFGF21蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌具有促进作用。9.将上述筛选并优化组合的重组菌株Kno6cf进行发酵条件优化,设置不同的诱导剂浓度和诱导温度,最终确定最适的发酵条件:0.2%（w/v）麦芽糖,37 oC,0 h诱导,发酵时间为24h。综上所述,本研究主要构建了枯草芽孢杆菌表达系统,显著提高了rhFGF21蛋白的可溶性表达水平并实现分泌。最终在摇瓶发酵水平上,rhFGF21蛋白胞内的可溶性表达量占总蛋白的22%,与首次在枯草芽孢杆菌中表达量相比提高了9.8倍,rhFGF21蛋白的分泌量占胞外总蛋白的14%。