弓形虫是世界性分布的专性细胞内寄生原虫，可引起人兽共患的弓形虫病。成人弓形虫感染多呈无症状带虫状态，但先天感染可导致流产、畸胎或死胎，在免疫缺陷者（如器官移植、恶性肿瘤、应用免疫抑制剂者及AIDS患者等）常是致死的主要原因之一，此外弓形虫也可引起禽畜疾病，给畜牧业生产造成严重的经济损失。因此，弓形虫病的防治对人类健康、优生优育及畜牧业发展等具有重大意义。乙胺嘧啶联合磺胺嘧啶可有效治疗弓形虫病，然而上述药物常引起严重的副反应，尤其在AIDS患者，常因此而中断治疗引起疾病复发，在孕期前16周感染弓形虫的孕妇因乙胺嘧啶潜在的致畸作用而禁用该类药物。因而，研制弓形虫疫苗已迫在眉睫。几十年来国内外学者在这方面进行了大量的基础性研究。经历了减毒活疫苗、亚单位疫苗后，出现了核酸疫苗。核酸疫苗是将某种保护性抗原的编码基因，克隆到真核细胞表达调控序列的质粒中，制成的DNA重组质粒直接接种宿主，宿主细胞摄取质粒后通过转录翻译，表达保护性抗原蛋白，从而诱导机体产生对该抗原的保护性免疫应答。与其他疫苗相比，核酸疫苗具有以下优点：1操作简单，只需接种质粒即可，其为体内真核表达，无须体外表达纯化；2产生CTL作用，对胞内寄生的原虫、病毒具有杀伤作用；3在宿主细胞的真核环境中表达的蛋白质更接近天然构象，诱导更有效的免疫应答；4免疫具有持续性，一次接种可获得长期免疫力，避免了死疫苗和重组亚单位疫苗等需反复多次加强免疫的繁琐；5可制备成多价疫苗；6便于储存和运输。鉴于此，DNA疫苗技术已成为热点被广泛应用于寄生虫病免疫预防的研究，其中疟疾DNA疫苗已获批准进入I、II期临床试验。在弓形虫疫苗研制方面，国内外学者已构建编码弓形虫ROP1、ROP2、SAG1、GRA4等基因真核重组质粒，并将重组质粒对小鼠进行了免疫研究，动物实验表明获得了较好的保护效果。核酸疫苗除用于预防疾病外，在制备高免抗血清、制备单克隆抗体及研究病原的保护性抗原等方面也得到了应用。 <WP=39>弓形虫GRA1基因编码的致密颗粒蛋白（GRA1）是弓形虫速殖子分泌排泄抗原（excreted-secreted antigen，ESA）之一，在人体和动物试验感染中具有较强免疫原性。Duquesne等进行了GRA1基因T细胞表位的研究，证明GRA1基因是一种极好的弓形虫侯选疫苗基因。弓形虫在一般人群中多呈隐性或慢性感染状态，因此存在于速殖子和缓殖子致密颗粒中的GRA1蛋白作为慢性感染的诊断抗原颇具有研究价值。1989年Cesbron-Delauw等[3]以弓形虫RH株为研究对象首次克隆了GRA1基因并报道了该基因的分子生物学特性，但至今未见有关GRA1基因内含子的报道。本研究实验一从接种了弓形虫RH株的小鼠腹水中收集、纯化速殖子，提取基因组总RNA。本文预计扩增的弓形虫GRA1基因片段位于原序列的第613~1240 bp之间，共628 bp。根据Genbank中GRA1基因的mRNA序列，设计合成了一对引物，并引入XhoI和BamHI酶切位点，用RT-PCR方法从弓形虫基因组总RNA中体外扩增GRA1基因的cDNA片段。扩增的目的基因片段经纯化回收、双酶切后，定向插入真核表达质粒pcDNA3中，然后转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞中，于氨苄青霉素阳性LB平板上筛选阳性克隆。对提取的重组子用XhoI和BamHI进行酶切鉴定及PCR鉴定，采用双脱氧链终止法测序，利用互联网与相关基因进行核苷酸同源性分析。研究结果表明，RT-PCR产物经1％琼脂糖凝胶上电泳鉴定，在628 bp处出现一特异性扩增条带，与预期值大小相符，测序结果与Genbank已发表序列相比，核苷酸的同源性为100％。表明从弓形虫基因组总RNA中扩增出编码保护性抗原GRA1的基因，成功构建了GRA1基因的真核表达重组质粒pcDNA3-GRA1。实验二提取弓形虫速殖子总DNA，用上述合成的一对引物，利用PCR方法以弓形虫基因组总DNA为模板扩增GRA1基因片段，PCR产物经T-A克隆后α互补筛选法筛选，提取阳性重组质粒，进行酶切鉴定及PCR鉴定，测序。结果表明，以弓形虫基因组DNA为模板，获得PCR产物为763bp，此测序结果已收录入 Genbank（登录号AY359678）。对GRA1基因DNA 序列和cDNA序列进<WP=40>行比较，发现获得的DNA序列较cDNA多出一135bp边界序列为GT-AG的核苷酸片段，由此推断出 GRA1基因为断裂基因，在原基因序列的860-861bp间存在一135bp的内含子。此外，DNA 与cDNA编码序列存在单碱基差异（第421位cDNA为A，而DNA为G），这可能与RNA编辑（RNA editing）有关。虽然GRA1基因DNA发生点突变（第421位A→G），但最终并未改变编码的氨基酸，提示RNA编辑可能是生物一种保护措施。本研究构建出pcDNA3-GRA1重组质粒，载体pcDNA3具有CMV的高效启动子和增强子，是一种外源基因在真核细胞中高效表达的理想载体，这为进一步在真核细胞和宿主细胞表达及最终获得具有生物学活性的GRA1蛋白提供了条件，从而为弓形虫病的诊断及核酸疫苗的研制奠定基础；本研究GRA1基因内含子的首次发现，丰富了该基因的分子生物学特性，为今后有关GRA1基因实验方法的选择提供依据。