【摘 要】
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【目的】研究5-氨基咪唑-4-羟酰胺核糖核酸甲酰转移酶（ATIC）在食管癌中的表达情况及其对食管癌细胞系KYSE-30,KYSE-150和Eca-109生物学功能影响和机制探讨,为食管癌的筛检与治疗提供新的临床思路。【方法】（1）首先运用生物数据库GEO和TCGA来分析食管癌中ATIC的m RNA的表达差异情况与食管癌患者临床病理相关性的分析以及与免疫细胞浸润之间的关系;通过实时荧光定量PCR技术
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【目的】研究5-氨基咪唑-4-羟酰胺核糖核酸甲酰转移酶（ATIC）在食管癌中的表达情况及其对食管癌细胞系KYSE-30,KYSE-150和Eca-109生物学功能影响和机制探讨,为食管癌的筛检与治疗提供新的临床思路。【方法】（1）首先运用生物数据库GEO和TCGA来分析食管癌中ATIC的m RNA的表达差异情况与食管癌患者临床病理相关性的分析以及与免疫细胞浸润之间的关系;通过实时荧光定量PCR技术（q RT-PCR法）和蛋白印迹技术（Western Blotting法）检测ATIC在20例食管癌患者癌组织以及癌旁组织表达情况;并从基因和蛋白水平检测KYSE-30,KYSE-150,Eca109和TE-1四株食管癌细胞系中ATIC的表达情况及选定后续实验细胞;（2）通过慢病毒转染技术,RNA转染技术和质粒过表达技术构建细胞的敲低和过表达模型;运用实时荧光定量PCR技术（q RT-PCR法）和蛋白印迹技术（Western Blotting法）检测模型构建是否成功;（3）通过划痕实验和Transwell穿孔能力研究来验证si-ATIC-KYSE30,sh-ATIC-KYSE150,sh-ATIC-Eca109及ATIC-Eca109细胞系的迁移能力变化情况;运用平板克隆技术和CCK8细胞增殖技术来研究敲低或过表达ATIC对食管癌细胞系增殖能力的改变情况;通过免疫印迹技术检测EMT相关蛋白及PCNA蛋白表达量,从蛋白水平揭示食管癌中ATIC与迁移侵袭及增殖的内在关系;（4）通过生物数据库功能富集及蛋白印迹技术（Western Blotting法）来进一步研究CDK5作为上游分子调控ATIC,从而影响ATIC在食管癌中的增殖和迁移作用,揭示两者的内在分子机制。【结果】（1）在GSE92396,GSE77861,GSE38129,GSE23400,GSE20347,TCGA共6个数据库中确定食管癌与正常食管组织中ATIC的m RNA的表达水平为ATIC在食管癌组织中高表达,且差异具有统计学意义;实时荧光定量PCR技术和蛋白印迹技术均证实ATIC在食管癌组织中的表达高于癌旁组织（P＜0.05）;然后运用实时荧光定量PCR技术和蛋白印迹技术确定KYSE-30,KYSE-150,Eca-109和TE-1四株食管癌细胞的ATIC表达情况,为下一步的选取合适的细胞系研究生物学表型打下基础;本课题组又进一步分析ATIC与食管癌之间的ROC曲线,结果显示AUC=0.848,两者之间具有很强的关联性,ATIC对于食管癌的发生发展具有预测能力;然后确定了ATIC的表达量高低与食管癌患者的T分期及主要治疗结果存在相关性;且在高表达ATIC的情况下,CD8 T细胞、DC细胞、巨噬细胞三种免疫细胞的浸润性低于低表达ATIC组;（2）根据ATIC的蛋白和RNA表达水平以及细胞的生长状态,因KYSE-30和KYSE-150细胞系的ATIC表达水平高,选取KYSE-30和KYSE-150做敲低ATIC组的生物学表型研究,Eca-109细胞系因ATIC的表达量适中,用Eca-109细胞系做敲低和过表达组细胞模型,用于研究其生物学功能;然后通过q RT-PCR法和Western Blotting法提示si-ATICKYSE30,sh-ATIC-KYSE150,sh-ATIC-Eca109及ATIC-Eca109细胞系模型构建成功;（3）敲低ATIC后,通过划痕愈合实验和Transwell穿孔实验显示食管癌细胞的迁移能力明显受到抑制（P＜0.05）,通过平板克隆实验,CCK8细胞增殖实验得知食管癌细胞的增殖能力减弱（P＜0.05）;过表达ATIC后,通过划痕愈合实验和Transwell穿孔实验显示食管癌细胞的迁移能力明显提高（P＜0.05）,通过平板克隆实验,CCK8细胞增殖实验得知食管癌细胞的增殖能力增强（P＜0.05）;而ATIC下调后上皮间质转化关键蛋白E-cadherin有明显的上升趋势（P＜0.05）,N-cadherin和Vimentin有明显的下降趋势（P＜0.05）,增殖关键蛋白PCNA表达量降低（P＜0.05）;而过表达ATIC后趋势与之相反,符合本课题组的实验猜想;（4）根据之前的研究发现CDK5可能与ATIC之间存在某种关联,敲低CDK5后,结果显示ATIC的表达水平随之降低（P＜0.05）,而m RNA水平无明显的变化;敲低ATIC后CDK5的蛋白表达水平无明显变化,提示CDK5可能作为ATIC在食管癌中的上游调节分子调控食管癌的增殖与迁移能力。【结论】食管癌中ATIC的表达水平高于癌旁组织,且高水平的ATIC可能有预测食管癌发生发展的能力;CDK5可能作为一个上游因子调控ATIC在食管癌细胞系中的增殖和迁移进程。
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