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目的:(1)探索不同浓度的FGF-2溶液对人羊膜间充质干细胞(Human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)向韧带和骨诱导的效果。(2)探究FGF-2慢病毒载体转染后的hAMSCs复合兔自体富血小板血浆(Platelet rich plasma,PRP)促进腱-骨愈合的可行性。方法:(1)通过酶消化法(2次胰酶消化,1次II型胶原酶消化)提取hAMSCs,连续传代培养,显微镜下观察hAMSCs的细胞形态,hAMSCs传至第三代(P3代hAMSCs)可用于后续实验;通过免疫荧光和流式细胞术对P3代hAMSCs进行鉴定。(2)用不同浓度(0,10,20,40 ng/ml)的FGF-2溶液对P3代hAMSCs进行诱导,CCK8法检测不同浓度的FGF-2溶液对hAMSCs增殖的影响;诱导14天后,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同浓度的FGF-2溶液诱导后的hAMSCs韧带和成骨相关基因的表达情况;Western Blot/免疫荧光检测不同浓度的FGF-2溶液诱导后的hAMSCs韧带和成骨相关蛋白的表达;天狼猩红染色检测不同浓度的FGF-2溶液诱导后的hAMSCs胶原表达情况。通过FGF-2慢病毒载体转染P3代hAMSCs,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况,qRT-PCR和Western Blot检测病毒的转染效率。(3)通过两次离心法制备兔自体PRP,并用牛凝血酶/Cacl2将PRP激活。(4)制备兔关节外腱-骨愈合模型:用3%戊巴比妥钠对新西兰大白兔进行麻醉(按0.5mL/kg的剂量),麻醉后进行备皮、消毒铺巾,在左后腿跟骨处向上切开皮肤,充分暴露跟腱,取一约2cm长的跟腱备用。在右侧胫骨上端内侧逐层切开皮肤,充分暴露胫骨上端,距胫骨上端约2cm处用口腔钻钻一直径为2.5mm的骨隧道,将取下的跟腱移植到骨隧道里,跟腱的两端分别留约0.5cm,并将其固定在周围的软组织上,以便术后取材和生物力学检测。跟腱移植到骨隧道固定后分别做以下处理:第一组:未做特殊处理(对照组);第二组:在骨隧道里注射自体激活的PRP(PRP组);第三组:将自体PRP与hAMSCs混合并激活后注射到骨隧道里(PRP+hAMSCs组);第四组:将自体PRP与FGF-2慢病毒载体转染的hAMSCs混合并激活后注射到骨隧道里(PRP+FGF-2-hAMSCs组)。逐层缝合切口,再次消毒,术后连续7天肌肉注青霉素20万U/只预防感染。术后3个月处死动物,取胫骨-移植物复合物进行大体观察、组织学检测(HE染色、番红固绿染色、甲苯胺蓝染色、Masson三色染色、天狼猩红染色)、影像学检测、生物力学检测观察腱-骨愈合情况。结果:(1)原代hAMSCs呈圆形或椭圆形贴壁生长,经过传代培养后逐渐呈涡旋状贴壁生长。免疫荧光结果提示:P3代hAMSCs高表达波形蛋白,不表达Cytokeratin 19(CK19);流式细胞术结果提示:P3代hAMSCs高表达间充质干细胞的表型分子CD44、CD73、CD90、CD105,几乎不表达CD19、CD34、CD45、CD11B、HLA-DR。(2)不同浓度的FGF-2溶液诱导hAMSCs后,CCK8结果提示:各组细胞增殖均呈S型曲线,10 ng/ml的FGF-2诱导组细胞增殖速度较对照组未见明显变化,而20 ng/ml和40 ng/ml的FGF-2诱导组其增殖能力较对照组明显提高,其中以40ng/ml最为明显。诱导后14天,qRT-PCR结果提示:不同浓度的FGF-2诱导组韧带和成骨相关基因表达明显上调,其中10 ng/ml的FGF-2诱导组韧带和成骨相关基因上调最明显;Western Blot/免疫荧光结果提示:不同浓度的FGF-2诱导组韧带和成骨相关蛋白表达明显上调,其中10 ng/ml的FGF-2诱导组韧带和成骨相关蛋白上调最明显;天狼猩红染色结果提示:各组细胞均可见胶原的分泌,胶原主要围绕着细胞核在细胞浆中分泌,对照组可见少量的胶原分泌,不同浓度的FGF-2诱导组胶原分泌明显高于对照组,其中10 ng/ml的FGF-2诱导组其胶原分泌最大,成网状排列。将FGF-2慢病毒载体以最适感染复数(MOI=50)转染P3代hAMSCs,24h后可见慢病毒转染组和空载质粒组有绿色荧光蛋白的表达,96h后绿色荧光蛋白的表达最强烈且稳定,未转染组在各个时间点均未见绿色荧光蛋白的表达;qRT-PCR和Western Blot结果提示:慢病毒转染组其FGF-2mRNA和蛋白的表达水平明显高于空载质粒组和未转染组(P<0.05),而空载质粒组和未转染组FGF-2 mRNA和蛋白的表达水平无统计学差异(P>0.05)。(3)将兔耳源静脉血第一次离心后,全血分三层,上层为血浆层、中间层为PRP层、下层为细胞层(红细胞)。将上层的血浆、中间的PRP及下层的细胞上面2mm转移至新的离心管再次离心后,PRP沉积在离心管的底部。将第二次离心后上面3/4的血浆去掉,保留下面1/4的PRP。此时的PRP是液体状,其内的各种生长因子含量少且活性较低。加入激活剂后(牛凝血酶/Cacl2),可将活性较低的PRP激活,使其由液体状变为凝胶状,此时的PRP具有较强的生物学活性,其内的大量生长因子被激活。(4)术后3个月,对照组移植物与骨隧道之间可见明显的间隙,并且骨隧道周围能够见到异常增生的组织;PRP组和PRP+hAMSCs组移植物和骨隧道之间的间隙较对照组有逐渐缩窄的趋势,但是其骨隧道周围组织的颜色和光泽较正常组织有明显的差别;PRP+FGF-2-hAMSCs组移植物和骨隧道之间的间隙几乎消失,骨隧道周围的色泽接近于正常的组织。组织学检测结果提示:PRP+FGF-2-hAMSCs组移植物和骨隧道之间几乎看不到间隙,无炎性细胞的存在,可见新生的纤维软骨,并且还可以看到大量排列整齐的胶原纤维,其腱-骨愈合情况优于其他各组。影像学结果提示:各组骨隧道均可见新生骨痂的形成,PRP+FGF-2-hAMSCs组其骨隧道直径较其他各组均明显降低。生物力学检测结果提示:PRP+FGF-2-hAMSCs组其力学强度明显高于其他各组。结论:(1)成功分离培养hAMSCs。(2)通过两次离心法成功制备了兔自体PRP。(3)FGF-2慢病毒载体介导的hAMSCs复合兔自体PRP能够促进兔腱-骨愈合。