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根据GLOBOCAN(http://globocan.iarc.fr/Default.aspx)世界卫生组织下属的国际癌症研究机构公布的数据认为乳腺癌是女性最常见的肿瘤之一，在全世界范围乳腺癌发病率是仅次于肺癌及结肠癌的第三大肿瘤，仅在2012年全世界范围内就有超过170万人被诊断出乳腺癌，每年超过100万人死于乳腺癌[1,2]。乳腺癌的死亡率在北美及欧洲一些发达国家呈现下降的趋势[3]，不过在一些亚洲国家，例如中国，乳腺癌的发病率及死亡率仍在不断上升[4]。传统的乳腺癌治疗方法有手术、化疗、放疗、内分泌治疗及靶向治疗等等，而随着治疗手段的丰富，乳腺癌病人的治愈率及带瘤生存时间得以大大延长，总体的乳腺癌病人生存率也是得到大大的提高。但是某些晚期乳腺癌病人，年轻的乳腺癌病人或者某些特殊分子病理类型的乳腺癌病人往往疾病进展很快，肿瘤转移、耐药往往难以得到控制，病人的预后也较差，机体免疫功能被抑制非常的常见。随着病人免疫功能的下降，患者机体自身对肿瘤细胞的识别和杀伤均受到抑制或功能失调，并且因为免疫功能的紊乱往往导致化疗的使用也收到限制。如果使用足量的化疗剂量会导致机体免疫细胞被化疗药杀伤，如果不使用足量的化疗剂量则会导致肿瘤得不到有效的治疗。因此导致了一个恶性循环，并且在这过程中肿瘤的耐药、转移，疾病的进展就会随之而发生。随着2015年美国总统奥巴马在国情咨文演讲中提出了―精准医学(precision medicine)‖计划，―精准医学‖发展日益得到进步。其中肿瘤患者的免疫调控机制，肿瘤微环境的研究也为免疫治疗的发展打下了夯实的基础，但是乳腺癌患者的免疫调控机制复杂，调控因素多种多样，所以目前对乳腺癌免疫治疗及调控机制目前并没有得到充分的研究。
B7家族是重要的免疫共刺激信号家族，我们都知道T细胞的活化需要双信号刺激，一个APCs所呈递的MHC-抗原复合物刺激信号，第二个是APC上的协同刺激因子B7家族及与T细胞相互作用产生协同刺激信号。B7家族不仅提供了正向刺激信号，同时也提供了负性调控抑制T细胞应答[7]。许多研究发现，肿瘤细胞上表达了多种B7家族负性调节信号受体，如PD-L1，CTLA-4等可以抑制机体免疫反应，导致肿瘤免疫逃避[8]。
目前研究发现在肿瘤免疫中起重要作用的CD274(PD-L1，B7-H1)是在1999年首次被克隆出来[9]，随后CD279(PD-1)也被鉴定出来与CD274(PD-L1)是配体与受体的关系[10]。而CD274(PD-L1)在人类肿瘤的表达谱已经被揭示研究过了[7]。除了肿瘤细胞外，在人类肿瘤相关的APC中包括肿瘤微环境树突状细胞(DC)，肿瘤引流淋巴结DCs[11,12]，巨噬细胞[13,14]，成纤维细胞[15]和T细胞[16]都能观察到高水平的CD274(PD-L1)蛋白表达。CD274(PD-L1)表达可以被许多细胞因子诱导或维持，其中干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)是最有效的[17,18]。肿瘤浸润性T细胞(tumor infiltrating T cells，TIL)，IFN-γ信号基因和CD274(PD-L1)之间的关系表明，效应T细胞衍生的IFN-γ有助于在肿瘤微环境中高水平的CD274(PD-L1)表达[19]。因此免疫诱导肿瘤细胞高表达CD274(PD-L1)被认为是肿瘤细胞针对免疫攻击所产生的适应性抵抗机制[20,21]。目前临床上也已经开发出了相应的免疫检查点抑制剂，如CTLA-4阻断抗体“ipilimumab”，“Tremelimumab”，CD274(PD-L1)阻断抗体“nivolumab”，“pembrolizumab”。他们通过阻断免疫检查点识别与结合从而增强T细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤，增强T细胞抗肿瘤治疗。
癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)(https://cancergenom e.nih.gov/)数据库是美国国家癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)和美国国家人类基因组研究所(National Human Genome Research Institute，NHG RI)的一个合作计划，在2015年12月13日正式启动。目前已经成功绘制了33种癌症综合的、多维度的关键基因变化图谱。TCGA数据库创造了一个基因数据分析渠道，能大规模且高效的收集、分析人类组织中基因组的变化情况。miRNAs(MicroRNAs)是一类内源性非编码单链小分子RNA，一般长约21~25个核苷酸，广泛存在于真核生物中。miRNA对靶基因的调控表现在转录后水平上，通过对靶基因mRNA的3’端非翻译区域(3’-untranslated region,3’-UTR)切割或对其翻译抑制两种机制来下调靶基因的表达。这两种机制的选择主要取决于它与靶基因mRNA序列互补的程度，如果miRNA与靶基因mRNA完全互补，miRNA将通过切割方式来调控靶基因；如果miRNA与靶基因mRNA不完全互补，miRNA将通过翻译抑制的方式来调控靶基因；并且对靶基因翻译的抑制可能需要多种miRNA分子的协同作用。miRNA对靶基因mRNA的切割是大多数植物、病毒和部分动物的miRNA调控靶基因的方式[5]。miRNA可以指导对靶基因mRNA的多次切割而本身保持完整，这种作用方式与siRNA类似。而在动物体内，大部分miRNA不能与靶基因的mRNA完全互补，故被认为主要通过翻译抑制的方式来调控靶基因。miRNA参与了细胞增殖、迁移、凋亡、分化等多种细胞生命活动的调节。大量研究证实miRNA在几乎所有的恶性肿瘤中都存在表达异常[6]。
至此，我们提出本研究的科学问题：是否存在miRNA靶向调控乳腺癌B7家族成员？并进行生物信息学分析和生物学实验对本问题进行解答。
研究目的：
通过生物信息学分析TCGA数据库乳腺癌数据，寻找筛选靶向乳腺癌B7家族的miRNA，并通过实验验证分析结果。
研究方法：
1、通过下载TCGA数据库乳腺癌转录谱数据及生存数据，使用R语言分析出所有差异表达的基因及miRNA，然后从表达差异的基因中筛选出了B7家族成员的表达情况。并使用miRNA靶基因预测数据库TargetScan，miRanda，DIANATOOLS，miRDB结合乳腺癌数据库中差异表达的miRNA预测调控B7家族的miRNA。利用CutoffFinder绘制B7家族成员和miRNA的生存曲线结合B7家族与miRNA相关性分析，得到可能调控B7家族额miRNA。
2、通过Q-PCR，westernblot验证TCGA数据库中乳腺癌B7家族表达的分析结果，并且通过转染hsa-miR-195mimic、hsa-miR-497mimic，双荧光素酶基因报告实验对hsa-miR-195、hsa-miR-497靶向调控CD274(PD-L1)进行验证。
3、通过构建LV-hsa-miR-195、LV-hsa-miR-497慢病毒颗粒，感染MDA-MB-231细胞，构建稳定过表达hsa-miR-195、hsa-miR-497细胞株，用Q-PCR，westernblot检测hsa-miR-195、hsa-miR-497及CD274(PD-L1)表达情况，并用CCK-8、平板细胞克隆形成实验验证hsa-miR-195、hsa-miR-497抑制CD274(PD-L1)影响乳腺癌细胞的增殖。
研究结果：
1、通过对TCGA数据库的分析发现B7家族十个成员里有九个是在乳腺癌病人中存在差异表达的，其中九个差异表达的B7家族成员中，CD80(B7-1)，CD86(B7-2)，CD274(B7-H1，PD-L1)，ICOSLG(B7-H2)，CD276(B7-H3)，NCR3LG1(B7-H6)，HHLA2(B7-H7)这七个在肿瘤组织中表达是上调的，而C10orf54(B7-H5)，PDCD1LG2(B7-DC)这两个B7家族成员表达是下调的(p＜0.05)。而VTCN1(B7-H4)在肿瘤组织较正常组织表达升高，但无统计学差异(p＞0.05)。我们进一步通过B7家族和miRNA生存分析，B7家族与miRNA的相关性分析，最后我们可以发现hsa-miR-195、hsa-miR-497可能靶向调控CD274(PD-L1)，hsa-miR-93、hsa-miR-340可能靶向调控NCR3LG1，hsa-miR-93可能靶向调控PDCD1LG2。
2、不同分子分型的乳腺癌细胞中B7家族的表达量不一样，但总体来说与数据库预测相一致，我们最后挑选了CD274(PD-L1)为我们下一步的研究对象，进一步研究hsa-miR-195、hsa-miR-497靶向调控CD274(PD-L1)。我们使用了50nM浓度及100nM浓度的hsa-miR-195mimic、hsa-miR-497mimic转染MDA-MB-231细胞，可以看到转染后细胞内源性的hsa-miR-195、hsa-miR-497表达显著升高，并且hsa-miR-195、hsa-miR-497表达水平随着miRNAmimic转染浓度的升高而升高，差异具有统计学意义(p＜0.05)，CD274(PD-L1)mRNA和蛋白的表达水平随转染mimic浓度升高而下降，差异具有统计学意义(p＜0.05)，提示着hsa-miR-195、hsa-miR-497能调控CD274(PD-L1)蛋白的表达水平。最后通过双荧光素酶报告基因实验确认hsa-miR-195、hsa-miR-497通过抑制CD274(PD-L1)的3’-UTR调控CD274(PD-L1)的表达。
3、通过慢病毒构建LV-hsa-miR-195、LV-hsa-miR-497稳定过表达细胞株，利用CCK8法检测细胞增殖，克隆形成实验检测细胞的接种成活率和克隆形成率，可以发现LV-hsa-miR-195，LV-hsa-miR-497细胞株增殖速率明显较231control组及LV-NC组降低，表明过表达hsa-miR-195，hsa-miR-497后能够抑制乳腺癌细胞的增殖。
研究结论：
在乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞中，hsa-miR-195，hsa-miR-497能够抑制CD274(PD-L1)的表达，且过表达hsa-miR-195，hsa-miR-497能够抑制乳腺癌细胞的增殖。
B7家族是重要的免疫共刺激信号家族，我们都知道T细胞的活化需要双信号刺激，一个APCs所呈递的MHC-抗原复合物刺激信号，第二个是APC上的协同刺激因子B7家族及与T细胞相互作用产生协同刺激信号。B7家族不仅提供了正向刺激信号，同时也提供了负性调控抑制T细胞应答[7]。许多研究发现，肿瘤细胞上表达了多种B7家族负性调节信号受体，如PD-L1，CTLA-4等可以抑制机体免疫反应，导致肿瘤免疫逃避[8]。
目前研究发现在肿瘤免疫中起重要作用的CD274(PD-L1，B7-H1)是在1999年首次被克隆出来[9]，随后CD279(PD-1)也被鉴定出来与CD274(PD-L1)是配体与受体的关系[10]。而CD274(PD-L1)在人类肿瘤的表达谱已经被揭示研究过了[7]。除了肿瘤细胞外，在人类肿瘤相关的APC中包括肿瘤微环境树突状细胞(DC)，肿瘤引流淋巴结DCs[11,12]，巨噬细胞[13,14]，成纤维细胞[15]和T细胞[16]都能观察到高水平的CD274(PD-L1)蛋白表达。CD274(PD-L1)表达可以被许多细胞因子诱导或维持，其中干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)是最有效的[17,18]。肿瘤浸润性T细胞(tumor infiltrating T cells，TIL)，IFN-γ信号基因和CD274(PD-L1)之间的关系表明，效应T细胞衍生的IFN-γ有助于在肿瘤微环境中高水平的CD274(PD-L1)表达[19]。因此免疫诱导肿瘤细胞高表达CD274(PD-L1)被认为是肿瘤细胞针对免疫攻击所产生的适应性抵抗机制[20,21]。目前临床上也已经开发出了相应的免疫检查点抑制剂，如CTLA-4阻断抗体“ipilimumab”，“Tremelimumab”，CD274(PD-L1)阻断抗体“nivolumab”，“pembrolizumab”。他们通过阻断免疫检查点识别与结合从而增强T细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤，增强T细胞抗肿瘤治疗。
癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)(https://cancergenom e.nih.gov/)数据库是美国国家癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)和美国国家人类基因组研究所(National Human Genome Research Institute，NHG RI)的一个合作计划，在2015年12月13日正式启动。目前已经成功绘制了33种癌症综合的、多维度的关键基因变化图谱。TCGA数据库创造了一个基因数据分析渠道，能大规模且高效的收集、分析人类组织中基因组的变化情况。miRNAs(MicroRNAs)是一类内源性非编码单链小分子RNA，一般长约21~25个核苷酸，广泛存在于真核生物中。miRNA对靶基因的调控表现在转录后水平上，通过对靶基因mRNA的3’端非翻译区域(3’-untranslated region,3’-UTR)切割或对其翻译抑制两种机制来下调靶基因的表达。这两种机制的选择主要取决于它与靶基因mRNA序列互补的程度，如果miRNA与靶基因mRNA完全互补，miRNA将通过切割方式来调控靶基因；如果miRNA与靶基因mRNA不完全互补，miRNA将通过翻译抑制的方式来调控靶基因；并且对靶基因翻译的抑制可能需要多种miRNA分子的协同作用。miRNA对靶基因mRNA的切割是大多数植物、病毒和部分动物的miRNA调控靶基因的方式[5]。miRNA可以指导对靶基因mRNA的多次切割而本身保持完整，这种作用方式与siRNA类似。而在动物体内，大部分miRNA不能与靶基因的mRNA完全互补，故被认为主要通过翻译抑制的方式来调控靶基因。miRNA参与了细胞增殖、迁移、凋亡、分化等多种细胞生命活动的调节。大量研究证实miRNA在几乎所有的恶性肿瘤中都存在表达异常[6]。
至此，我们提出本研究的科学问题：是否存在miRNA靶向调控乳腺癌B7家族成员？并进行生物信息学分析和生物学实验对本问题进行解答。
研究目的：
通过生物信息学分析TCGA数据库乳腺癌数据，寻找筛选靶向乳腺癌B7家族的miRNA，并通过实验验证分析结果。
研究方法：
1、通过下载TCGA数据库乳腺癌转录谱数据及生存数据，使用R语言分析出所有差异表达的基因及miRNA，然后从表达差异的基因中筛选出了B7家族成员的表达情况。并使用miRNA靶基因预测数据库TargetScan，miRanda，DIANATOOLS，miRDB结合乳腺癌数据库中差异表达的miRNA预测调控B7家族的miRNA。利用CutoffFinder绘制B7家族成员和miRNA的生存曲线结合B7家族与miRNA相关性分析，得到可能调控B7家族额miRNA。
2、通过Q-PCR，westernblot验证TCGA数据库中乳腺癌B7家族表达的分析结果，并且通过转染hsa-miR-195mimic、hsa-miR-497mimic，双荧光素酶基因报告实验对hsa-miR-195、hsa-miR-497靶向调控CD274(PD-L1)进行验证。
3、通过构建LV-hsa-miR-195、LV-hsa-miR-497慢病毒颗粒，感染MDA-MB-231细胞，构建稳定过表达hsa-miR-195、hsa-miR-497细胞株，用Q-PCR，westernblot检测hsa-miR-195、hsa-miR-497及CD274(PD-L1)表达情况，并用CCK-8、平板细胞克隆形成实验验证hsa-miR-195、hsa-miR-497抑制CD274(PD-L1)影响乳腺癌细胞的增殖。
研究结果：
1、通过对TCGA数据库的分析发现B7家族十个成员里有九个是在乳腺癌病人中存在差异表达的，其中九个差异表达的B7家族成员中，CD80(B7-1)，CD86(B7-2)，CD274(B7-H1，PD-L1)，ICOSLG(B7-H2)，CD276(B7-H3)，NCR3LG1(B7-H6)，HHLA2(B7-H7)这七个在肿瘤组织中表达是上调的，而C10orf54(B7-H5)，PDCD1LG2(B7-DC)这两个B7家族成员表达是下调的(p＜0.05)。而VTCN1(B7-H4)在肿瘤组织较正常组织表达升高，但无统计学差异(p＞0.05)。我们进一步通过B7家族和miRNA生存分析，B7家族与miRNA的相关性分析，最后我们可以发现hsa-miR-195、hsa-miR-497可能靶向调控CD274(PD-L1)，hsa-miR-93、hsa-miR-340可能靶向调控NCR3LG1，hsa-miR-93可能靶向调控PDCD1LG2。
2、不同分子分型的乳腺癌细胞中B7家族的表达量不一样，但总体来说与数据库预测相一致，我们最后挑选了CD274(PD-L1)为我们下一步的研究对象，进一步研究hsa-miR-195、hsa-miR-497靶向调控CD274(PD-L1)。我们使用了50nM浓度及100nM浓度的hsa-miR-195mimic、hsa-miR-497mimic转染MDA-MB-231细胞，可以看到转染后细胞内源性的hsa-miR-195、hsa-miR-497表达显著升高，并且hsa-miR-195、hsa-miR-497表达水平随着miRNAmimic转染浓度的升高而升高，差异具有统计学意义(p＜0.05)，CD274(PD-L1)mRNA和蛋白的表达水平随转染mimic浓度升高而下降，差异具有统计学意义(p＜0.05)，提示着hsa-miR-195、hsa-miR-497能调控CD274(PD-L1)蛋白的表达水平。最后通过双荧光素酶报告基因实验确认hsa-miR-195、hsa-miR-497通过抑制CD274(PD-L1)的3’-UTR调控CD274(PD-L1)的表达。
3、通过慢病毒构建LV-hsa-miR-195、LV-hsa-miR-497稳定过表达细胞株，利用CCK8法检测细胞增殖，克隆形成实验检测细胞的接种成活率和克隆形成率，可以发现LV-hsa-miR-195，LV-hsa-miR-497细胞株增殖速率明显较231control组及LV-NC组降低，表明过表达hsa-miR-195，hsa-miR-497后能够抑制乳腺癌细胞的增殖。
研究结论：
在乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞中，hsa-miR-195，hsa-miR-497能够抑制CD274(PD-L1)的表达，且过表达hsa-miR-195，hsa-miR-497能够抑制乳腺癌细胞的增殖。