Graves病(Graves disease,GD)是以甲状腺肿大与功能亢进为主要特征的自身免疫性甲状腺疾病,近年来发病有上升趋势。抗甲状腺药物是当前GD治疗的主要方式,但存在停药后复发率高的风险,而甲状腺肿大是影响本病转归的重要因素。导师认为“痰凝于颈前”是GD的核心特征,其以化痰散结为基本治法治疗GD在临床应用中取得良好疗效。在此基础上,导师开展了化痰散结法干预GD的基础研究,先后获得4次国家自然科学基金资助。本研究在国家自然科学基金“化痰散结法对Graves病小鼠免疫耐受开关机制及其修饰的影响”(No.81774293)的资助下,在课题组既往研究的基础上,探索化痰散结法对GD小鼠免疫耐受的关键机制。第一章GD小鼠模型优化目的:观察1次免疫法构建GD小鼠模型的成模时间、成模率与维持时间,为研究提供载体。方法:构建Ad-TSHR289腺病毒,将BALB/c小鼠分为模型(GD)组与正常(NC)组。GD组于实验的第1周进行2*109Pfu病毒注射,NC组给予同等的PBS溶液。于第4周、第7周、第13周、第18周,分别处死等量的GD组与NC组小鼠,留血检测T4、TRAb含量,并观察甲状腺形态学变化,HE染色观察。结果:(1)甲状腺功能:在第4周时,GD组T3的阳性比例为4/6,T4的阳性比例为3/6;在第7周时,GD的T3的阳性比为6/6,T4阳性率为5/6,在第13周时,GD的T3的阳性率为6/6,T4阳性率为5/6;在第18周时,GD的T3与T4的阳性率为6/6。各时期TRAb的阳性率均为6/6。(2)甲状腺形态:在第4周时,NC组与GD组的甲状腺一般形态观察无明显肿大,但GD组的甲状腺系数(甲状腺质量/体重,TW/BW)较NC组显著增高(P<0.05)。GD组HE染色发现,甲状腺滤泡上皮细胞轻度增生,滤泡腔表面光滑,滤泡腔内胶质充盈。从第7周起,GD组甲状腺肿大明显,肿大比例为5/6,GD组TW/BW较NC组显著增高(P<0.001),GD组甲状腺滤泡上皮细胞增生明显,多处向内凸起,腔内胶质减少。第13、18周时,GD组甲状腺肿大明显,肿大比例为6/6,GD组TW/BW较NC组显著增高(P<0.001),GD组甲状腺滤泡上皮细胞增生进一步加重,腔内胶质减少,局部腔内融合。(3)从第4周起,GD组血清T3含量逐步上升,至13周时T3含量较第4周时有显著性差异(P<0.05),至第18周时T3含量较第4周时显著升高(P<0.01)。GD组T4含量从第4周起逐步上升,至第7周达到高峰,第7、13、18周的血清T4含量与第4周时相比,差异有统计学意义(P<0.05),第7-18周基本趋于稳定,第7、13、18周各时间段中T4含量差异无统计学意义(P>0.05)。GD组TRAb含量从第4周起逐步上升,至第7周达到高峰,TRAb含量升高有统计学意义(P<0.01),第7周至13周,TRAb含量降低(P<0.05),第13-18周,TRAb含量趋于稳定,变化无统计学意义(P>0.05)。而GD组的TW/BW的趋势与血清T4含量一致。(4)T3、T4、TRAb和TW/BW均呈显著性正相关性。结论:1次免疫法构建的GD小鼠模型,第4周可鉴定成模,维持时间可至第18周,第7周后成模率达83.33%以上,可作为疾病研究的载体。第二章化痰散结法对GD小鼠甲状腺功能与形态异常的影响目的:观察化痰散结药物对GD小鼠甲状腺功能与形态的作用,进一步评价药效并探讨改善甲状腺肿大的作用机制。方法:(1)分组与给药:本实验共分为4组,即正常对照(NC)组,模型(GD)组,甲巯咪唑(MMI)组、化痰散结药物(HTSJ)组。GD组、MMI组、HTSJ组按照第一章方法造模。给药干预:根据人鼠等效剂量换算,MMI组小鼠给于赛治(甲巯咪唑片)23 mg/kg/d,HTSJ组小鼠给予中药相对生药量7 g/kg/d,分别混悬于纯水中。按照20 g小鼠每天给予0.2 mL液体计算。每日灌胃1次,NC组与GD组给予等体积纯水灌胃。给药干预6周。(2)放免法检测T4、TRAb的含量。(3)HE染色观察小鼠甲状腺形态、扫描电镜观察甲状腺组织表面形态。结果:(1)甲状腺功能:与NC组相比,GD组小鼠血清中的T4含量显著升高(P<0.001),而与GD组比较,MMI组与HTSJ组T4含量均显著降低(P<0.001),说明药物干预可改善甲状腺激素水平。与NC组比较,GD组血清中TRAb的含量显著性升高(P<0.001),而经过药物干预后,MMI组与HTSJ组较GD组均显著降低(P<0.001)。(2)HE染色与扫描电镜:NC组甲状腺滤泡上皮细胞呈扁平状,排列较为整齐,滤泡边缘光滑,滤泡腔内充盈。GD组的甲状腺滤泡上皮细胞增生显著,滤泡边缘粗糙,可见不规则滤泡上皮细胞内凸,滤泡腔内物质欠充盈,部分区域融合。经过6周药物治疗干预后,MMI组滤泡上皮细胞增生减轻,内凸明显减少,形体有较大改变,滤泡腔内充盈。在400倍镜下观察发现,MMI组的滤泡上皮细胞仍存在增生。HTSJ组甲状腺滤泡上皮细胞增生减轻明显,无内凸,滤泡腔内充盈。HTSJ组甲状腺组织形态恢复优于MMI组。扫描电镜下观察到:NC组甲状腺滤泡上皮细胞表面可见球状结构,无明显微绒毛。GD组表面可见大量密集细长的微绒毛,提示TSH刺激的胞吞作用活跃,细胞表面代谢面积增大。经过药物干预6周后,MMI组与HTSJ组甲状腺滤泡上皮细胞表面微绒毛均明显减少,但MMI组微绒毛仍细长,HTSJ组微绒毛缩短明显、稀疏。提示经药物干预后,TSH刺激的胞吞作用减弱,细胞表面代谢面积减小。结论:化痰散结药物能够显著降低GD小鼠T4、TRAb水平,改善甲状腺组织形态。第三章化痰散结法对GD小鼠甲状腺组织氧化应激的影响目的:观察化痰散结药物对GD小鼠甲状腺组织氧化因子作用,进一步探索其改善甲状腺肿大的作用机制。方法:试剂盒检测小鼠甲状腺组织中T-SOD、MDA、GSH-px、GSH、T-AOC的含量。结果:与NC组比较,GD组甲状腺组织中的T-SOD含量显著降低(P<0.001),经过药物干预后,MMI组与HTSJ组较GD组的T-SOD含量均有不同程度升高,但均无统计学意义(P>0.05)。与NC组比较,GD组小鼠甲状腺组织中MDA的含量有升高趋势,但无统计学意义(P>0.05);经过药物干预后,MMI组MDA含量较GD组显著降低(P<0.01),HTSJ组有下降趋势,但无统计学差异(P>0.05。与NC组比较,GD组小鼠甲状腺组织中的GSH-px含量显著降低(P<0.05);经过药物干预后,MMI组与HTSJ组具有上升趋势,但统计学学差异(P>0.05)。与NC组相比,GD组甲状腺组织中T-AOC的含量显著降低(P<0.05)。与GD组相比,MMI组与HTSJ组的T-AOC含量均显著提高(P<0.01;P<0.05)。与NC组比较,GD组的GSH含量显著降低(P<0.05),而经过药物干预后,MMI组较GD组GSH含量提高有统计学差异(P<0.05),HTSJ组较GD组GSH含量显著升高(P<0.01);与MMI组相比,HTSJ组升高GSH含量更加显著(P<0.05)。结论:化痰散结药物调节甲状腺组织中的氧化与抗氧化平衡。第四章化痰散结法对GD小鼠Th1/Th2细胞免疫失衡影响目的:观察化痰散结药物对GD小鼠Th1/Th2细胞平衡的影响,以研究化痰散结法对免疫失衡的调控机制。方法:(1)测量小鼠脾脏系数(脾脏质量/体质量)。(2)处死小鼠后取脾脏制备淋巴细胞悬液,先后添加CD3-percp、CD4-FITC、IL-4-PE、IFN-γ-APC等抗体后进行流式细胞术检测。(3)利用RT-PCR检测Th1与Th2细胞特异性转录因子 T-bet 与 GATA-3 的表达。(4)Elisa 检测 IL-2、IFN-y、IL-4、IL-6 的含量。结果:(1)GD组小鼠脾脏系数较NC组小鼠显著性升高(P<0.001),MMI组与HTSJ组的脾脏指数较GD组小鼠不同程度的下降(P<0.05;P<0.01)。(2)与NC组相比,GD组Th1细胞占Th细胞比值升高,差异有统计学意义(P<0.05),MMI与HTSJ药物一定程度降低Th1的表达,但无统计学差异(均P>0.05);与NC组比较,GD小鼠的Th2细胞的表达显著降低(P<0.05),与GD组相比,MMI与HTSJ药物干预后,Th2细胞表达有上升趋势,但均无统计学差异(P>0.05)。通过比较Th1/Th2的比值发现,GD组比值较NC显著升高(P<0.001),经过MMI与HTSJ药物干预后,Th1/Th2的比值较模型组均有一定程度降低,其中化痰散结药物干预后改善明显(P<0.05)。(3)与NC组相比,GD组脾脏组织中T-bet的表达显著上调(P<0.001)。经过药物干预后,与GD组比较,MMI与HTSJ组的mRNA的表达显著下调(P<0.01)。与NC组比较,GD组脾脏组织中GATA-3的表达显著下调(P<0.05),而经过药物干预后,MMI与HTSJ组的GATA-3的mRNA的表达较GD组均有上升趋势。(4)GD组小鼠血清中IFN-γ较NC组显著升高,有统计学意义(P<0.001),经过药物干预后,MMI组与HTSJ组较GD组降低(P<0.01;P<0.05)。与NC组比较,GD组小鼠血清中IL-2含量显著升高,有统计学意义(P<0.01),经过药物干预后,与GD组比较,MMI组明显降低(P<0.05),HTSJ组IL-2血清含量有下降趋势(P>0.05)。与NC组比较,GD组小鼠血清中IL-4含量显著降低,有统计学意义(P<0.01);与GD组比较,MMI组与HTSJ组IL-4的含量有上升趋势,但无统计学意义(均P>0.05)。与NC组比较,GD组血清中IL-6含量增高,有统计学意义(P<0.001);经过MMI与HTSJ药物治疗后,IL-6的含量均明显降低(P<0.01)。结论:化痰散结药物能够调控Th1/Th2特异性转录因子T-bet、GATA-3的基因表达,调节Th1/Th2分泌细胞因子的水平,改善Th1/Th2细胞表达的平衡。第五章化痰散结法对GD小鼠免疫耐受失常的影响目的:通过研究化痰散结药物对GD小鼠Treg细胞表达与Treg细胞免疫抑制以及分泌的细胞因子的作用,研究化痰散结法对GD小鼠免疫耐受的影响方法:(1)通过流式细胞术检测Treg细胞的表达。(2)磁珠分选后制备CD4+CD25+细胞与CD4+CD25-细胞共培养,加入CCK-8溶液,酶标仪检测,计算免疫抑制率。(3)Elisa试剂盒检测IL-10与TGF-β的含量。结果:(1)与NC组比较,GD组的Treg细胞含量显著降低(P<0.001)。与GD组相比,MMI组与HTSJ组有统计学差异(P<0.05)。(2)CD4+CD25-单独培养时,即20000:0,各组检测OD值基本一致,而将其与CD4+CD25+细胞共同培养时(20000:20000;20000:10000),各组OD值均有不同程度降低;在CD4+CD25-与CD4+CD25+以20000:20000的细胞数量培养时,GD组与NC组相比,抑制率显著降低(P<0.05),而经过药物干预后,MMI组与HTSJ组较GD组免疫抑制率均有一定提高,其中HTSJ组抑制率升高具有统计学差异(P<0.05);(3)GD组小鼠血清中IL-10较NC组显著下降,有统计学意义(P<0.001),经过药物干预后,MMI组与HTSJ组较GD组上升(均P<0.001)。与NC组比较,GD组小鼠血清中TGF-β含量显著下降,有统计学意义(P<0.01),经过药物干预后,与GD组比较,HTSJ组明显升高(P<0.05),MMI组TGF-β血清含量有下降趋势(P>0.05)。结论:化痰散结法具有维持GD小鼠免疫耐受稳定的作用。第六章化痰散结法对GD小鼠免疫耐受失常的上游调控的影响目的:观察化痰散结药物对GD小鼠脾脏Foxp3的DNA甲基化与Hippo信号通路的影响,研究化痰散结法对GD小鼠免疫耐受异常的上游调控机制。方法:(1)采用免疫磁珠分选法分选出CD4+CD25+Treg细胞,DNA提取检测、亚硫酸盐处理及纯化、扩增测序。(2)采用RT-PCR检测脾脏组织中Hippo信号通路Mstl、YAP1、TAZ的基因表达。结果:(1)在CpG2、CpG3、CpG4、CpG6等位点,与NC组小鼠比较,GD组小鼠的Foxp3的DNA甲基化程度显著升高(P<0.05)。在上述位点,与GD组比较,MMI组与HTSJ组的DNA甲基化程度无明显变化(P>0.05),在CpG6位点,MMI组与HTSJ组较GD组有降低趋势。CpGl、CpG5、CpG7位点,各组无明显差异(P>0.05)。(2)结果显示,与NC组比较,GD组Mstl表达下调,YAP、TAZ表达上调(P<0.05);与GD组比较,MMI组与HTSJ组的Mstl的相对表达量上调,YAP、TAZ的表达下调(P<0.05)。与YAP1的结果相同,GD组小鼠脾脏中TAZ的表达较NC组显著上调,经过药物干预后,两组均有不同程度的改善(P<0.01)。结论:Foxp3的DNA甲基化可能是GD小鼠的发病因素之一,但化痰散结药物对其调控无明显作用。化痰散结药物能够影响Hippo信号通路关键因子的表达,可能是其调控Foxp3表达的方式之一。全文结论:化痰散结药能够调控Hippo信号通路关键因子(Mstl、YAP、TAZ)的表达,提高Foxp3的表达,进而增强Treg的分泌与免疫抑制作用,恢复Th1/Th2平衡,改善整体免疫失常状态,同时能够调节甲状腺组织中的抗氧化与氧化平衡,从而对GD小鼠起到治疗作用。