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研究背景糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）是我国第三大慢性疾病。糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）指DM患者发生的一种慢性肾功能丧失的疾病,为DM中最常见的并发症之一。近年来的研究发现DN患者的数量随着DM发病率的升高而升高。研究显示,DN是终末期肾病（end stage renal disease,ESRD）的主要原因之一[1],患者需要透析和移植等肾脏替代治疗。DN的病因及发病机制复杂,是多因素、多环节相互作用的结果,其中脂代谢紊乱是DN发生发展的危险因素[2]。DN既往的研究主要关注肾脏肾小球损伤,近年来研究发现肾小管间质损伤在DN发病机制也具有重要作用,且肾小管间质损伤出现在DN发病早期,而不是继发于肾小球病变。目前DN中肾小管损伤的机制尚不明确,有待进一步研究。Dach1基因（dachshund homolog 1）最早被认为是一种新型的抑癌基因。随着深入研究发现,DACH1蛋白对胰岛细胞发育[3]、胰岛素表达[4]和胰岛素抵抗[5]有重要调节作用。在人类全基因组学研究中发现,DACH1的单核苷酸多态性与成年人的肾功能不全相关,推测DACH1和肾病有密切的关系[6]。在多种肾病患者肾脏中DACH1表达量下降,且与血清肌酐呈负相关,DACH1可能是一种潜在的肾小球疾病进展和疾病严重程度的一个标志[7]。目前DACH1在DN发生和发展中的作用及其机制研究尚未见报道。卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin vaccine,BCG）是世界范围内应用最广泛的结核病疫苗,同时为一种强免疫佐剂可提高宿主的免疫力。它对天然免疫和获得性免疫均具有调节作用[8]。1型糖尿病接种BCG后引起多种免疫调节可降低血糖水平[9]。目前,BCG免疫对2型糖尿病的免疫调节作用仍未阐明。研究目的探究DACH1蛋白在肾小管上皮细胞和糖尿病小鼠肾脏的表达情况;研究棕榈酸诱导肾小管上皮细胞损伤及细胞自噬情况;明确DACH1对棕榈酸诱导肾小管上皮细胞自噬的调节作用;明确BCG免疫对2型糖尿病小鼠免疫应答和血糖水平的影响,并探究BCG免疫对糖尿病小鼠血糖及肾脏DACH1和自噬相关基因表达情况。研究方法和结果1.DACH1在HK-2细胞和糖尿病小鼠肾脏的表达Western blot检测表明,人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞）表达DACH1蛋白。C57BL/6J雄性小鼠喂养高糖高脂饮食和小剂量多次腹腔注射链尿佐菌素以建立2型糖尿病模型。正常对照组和糖尿病组小鼠体重无差异。糖尿病组小鼠肾脏HE染色结果表明,肾小球增生肥大,肾小管管腔变窄,部分上皮细胞肥大,胞浆发生空泡样变性。Western blot和免疫组化检测结果表明,糖尿病小鼠肾脏中DACH1表达较正常对照组下降。2.棕榈酸对HK-2细胞的损伤作用应用不同浓度的棕榈酸干预HK-2细胞,设定不同的时间点,MTS、台盼蓝染色实验检测细胞活力和死亡。结果显示,随着棕榈酸的浓度增高和干预时间延长,HK-2细胞活力降低,细胞死亡增加,同时流式细胞术检测结果显示HK-2细胞凋亡数增加。Western blot和免疫荧光检测显示,随棕榈酸浓度增加,HK-2细胞E-Cadherin蛋白表达下降。3.DACH1对棕榈酸诱导HK-2细胞自噬的调控作用HK-2细胞使用不同浓度的棕榈酸干预48h,Western blot及细胞免疫荧光检测显示,DACH1蛋白表达随棕榈酸浓度的升高而下降,自噬相关基因Beclin1、LC3蛋白水平均随棕榈酸浓度升高而升高。qRT-PCR检测结果显示,HK-2细胞Beclin1、LC3转录水平随棕榈酸浓度的升高而升高。脂质体法将过表达DACH1质粒转染HK-2细胞,Western blot和细胞免疫荧光检测可见DACH1蛋白表达明显升高。Western blot检测结果显示,过表达DACH1的HK-2细胞可以部分逆转棕榈酸诱导的Beclin1、LC3表达升高。4.BCG免疫对糖尿病小鼠血糖和肾脏DACH1表达的影响5×104CFU/只BCG经尾静脉免疫C57BL/6J小鼠,随后采用高糖高脂饮食和小剂量多次腹腔注射链尿佐菌素构建2型糖尿病模型。各组小鼠体重均呈上升趋势,各组间无显著差异。空腹血糖和葡萄糖耐量实验结果表明BCG免疫下调2型糖尿病小鼠空腹血糖和糖负荷后的血糖水平。糖尿病组和免疫组脾淋巴细胞IL-2、IL-6分泌水平均呈升高趋势,而免疫糖尿病组IL-6分泌水平显著低于糖尿病组（P<0.01）。各组间IL-10分泌水平无差异（P>0.05）。与正常组相比,糖尿病小鼠及免疫糖尿病组小鼠肾脏中DACH1表达均降低（P<0.05,P<0.05）,但两者无统计学差异。糖尿病组、免疫组和免疫糖尿病小鼠较正常对照组自噬均上调,但这三者之间无统计学差异。结论本研究结果表明,人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞）和糖尿病小鼠肾脏均表达DACH1。棕榈酸以浓度和时间依赖方式抑制HK-2细胞活力,增加细胞死亡,诱导自噬发生。过表达DACH1能部分逆转棕榈酸诱导的HK-2细胞自噬发生。BCG免疫可能通过调节血糖水平和抑制炎症因子释放延缓2型糖尿病小鼠的发展进程。BCG免疫对糖尿病小鼠DACH1表达和自噬的影响不显著。