伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科水痘病毒属,是一种双股DNA病毒,是猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）的病原,该病毒可引起猪呼吸道症状、神经症状和繁殖障碍等症状,猪是PRV的主要易感动物,是PRV最重要的传染源之一,对其它哺乳动物以及野生动物则具有致死性,近几年我国流行的PRV变异株给我国养猪业造成了巨大的经济损失。PRV作为疱疹病毒的代表之一,具有疱疹病毒的神经嗜性以及潜伏感染等特征。仔猪感染PRV后死亡率可高达100%,而成年猪感染后一般不产生明显的临床症状或临床症状较为轻微,多数病例呈一过性反应,但康复后PRV不会在体内完全清除,常潜伏在成年猪三叉神经节（Trigeminal ganglion,TG）中,受感染猪体内终身带毒且会不断向外界排放,导致其他同群其它猪被传染。控制和消灭猪PRV潜伏感染是当今PRV研究方向的重点课题,而目前国内外对PRV在TG内潜伏感染的建立、维持以及激活的分子机制研究甚少。有研究表明,PI3K/Akt信号通路对疱疹病毒潜伏感染的维持与病毒的激活起到了重要的作用,而对PRV感染TG及其原代细胞对PI3K/Akt信号通路的影响以及潜伏感染的维持与激活方面目前还未见报道。为探究这一科学问题,本试验通过PRV感染小鼠以及制备小鼠TG原代细胞,从体内以及体外两个方面分别探究PRV对TG细胞PI3K/Akt信号通路的影响及转导的分子机制,为弄清楚PI3K/Akt信号通路在PRV感染TG及其细胞潜伏感染以及激活的机制提供线索。本试验的相关研究内容如下:1.PRV感染小鼠对其三叉神经节PI3K/Akt信号通路的影响本试验以小鼠作为PRV的体内感染模型,用实验室分离鉴定的PRV Guizhou-DY株（Gen Bank登录号:JX417716）通过滴鼻的形式进行体内攻毒。试验分为设立10 000 TCID50感染量PRV感染的低感染量组以及用50 000 TCID50感染量PRV感染的高感染量组,分别在感染后12 h、24 h、48 h观察小鼠临床症状并处死部分小鼠取出其TG。结果发现:高剂量PRV感染小鼠24 h后出现兴奋、瘙痒、被毛凌乱、抓挠面部及耳部进而出血破溃等临床症状,在感染后的48 h后不断发病死亡;而低剂量PRV感染小鼠后无明显的临床症状,且感染后7 d内基本不发生死亡,通过PCR检测发现在攻毒小鼠TG内均能检测出PRV核酸,说明PRV感染小鼠攻毒成功。通过相对定量q-PCR及Western blot分别检测不同感染量PRV感染小鼠后其体内三叉神经节PI3K、Akt mRNA表达规律以及PI3K/Akt信号通路的蛋白表达规律。实验结果显示,与对照组相比各感染组PI3K、Akt mRNA的表达均呈明显的下调状态（P<0.05）,PI3K mRNA随着病毒的感染量提高其下调的更为明显（P<0.05）,而Akt的mRNA表达与病毒感染量无关（P>0.05）,且各组PI3K、Akt mRNA表达的下调也与感染时间无关（P>0.05）。WB结果显示低剂量PRV感染小鼠后的PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达均无明显变化（P>0.05）;而高剂量PRV感染小鼠组PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达均有所提高且呈时间依赖性诱导模式（P<0.05）,说明高剂量PRV会激活小鼠TG内PI3K/Akt信号通路。2.PRV感染TG原代细胞对其PI3K/Akt信号通路的影响根据实验室前期研究以及相关文献,首先对小鼠TG细胞原代培养的方式进行优化,主要优化方式包括通过提高TG细胞接种密度、二次贴壁法、更换培养基和多聚赖氨酸铺板等方法对TG细胞进行培养。结果显示,经过提高细胞接种密度以及二次贴壁法培养,不但不能促进TG原代细胞的贴壁,反而对细胞贴壁产生了抑制作用,细胞密度有减无增;而将贴壁用培养基由DMEM（高糖）更换为DMEM/F12后TG细胞密度虽然没有提高,但是细胞形态更为清晰;而使用D型多聚赖氨酸铺板后对TG细胞进行培养可有效促进TG细胞的贴壁与生长,细胞密度有了极大的提升,但对TG细胞的生长发育速度无明显改善,说明D型多聚赖氨酸铺板法培养TG原代细胞可行。通过透射电镜,观察PRV是否感染TG细胞并在其内增殖,结果显示,未产生CPE的TG细胞以及产生CPE的TG细胞在细胞核内均发现了未成熟的病毒粒子,同时在细胞质内观察到空泡、自噬、线粒体肿胀等细胞病变特征,说明PRV可以感染TG细胞。将1 MOI PRV感染小鼠TG细胞后,分别检测不同时间段PI3K、Akt的mRNA表达变化以及PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达变化。结果显示,PRV感染TG细胞的早期可显著上调PI3K、Akt mRNA表达水平（P<0.01）,PI3K mRNA表达在30 min左右达到峰值,Akt mRNA的表达在15min即达到峰值,随后迅速下降,呈现出PRV感染TG细胞后对PI3K及Akt mRNA的表达先促进后抑制的状态。对蛋白表达的影响方面,PRV感染TG细胞后可显著抑制PI3K的蛋白表达（P<0.01）,但随着感染时间的推移表达量无明显变化,Akt蛋白的表达呈现先促进后抑制的状态（P<0.01）,这一结果与mRNA的表达相符,且PRV在感染的早期会诱导TG细胞Akt的磷酸化,在感染后3～6 h时Akt的磷酸化下调并消失。同时通过间接免疫荧光试验观察到PRV感染TG细胞早期可明显诱导Akt发生的磷酸化,实验结果说明PRV感染TG细胞可激活PI3K/Akt信号通路。3.PI3K/Akt信号通路对PRV感染TG细胞后对其凋亡的影响为了证实PRV是否通过PI3K/Akt信号通路调控其在TG细胞的潜伏感染,本实验利用PI3K抑制剂LY294002对TG细胞内PI3K/Akt信号通路进行阻断,通过WB对阻断效果进行检测验证,结果显示10μmol LY294002可有效抑制由PRV感染引起的TG细胞Akt的磷酸化,说明TG细胞内PI3K/Akt通路的激活是以PI3K依赖的方式所诱导的,且LY294002可有效阻断TG细胞内PI3K/Akt通路。为了探究PI3K/Akt信号通路在PRV感染TG细胞后对其凋亡的影响,本试验首先采用Annexin V-FITC原位细胞染色法对细胞凋亡进行镜下观察,为排除脂溶性对TG细胞凋亡的影响,试验分为6组,分别为空白对照组、LY294002对照组、PRV 3 h以及6 h感染组、PRV+LY294002 3 h以及PRV+LY294002的6h感染组。结果显示,空白对照组、LY294002组以及PRV感染组没有或很少有红色以及绿色荧光染色,但随着PRV感染时间的延长,有少量的TG细胞出现凋亡情况;而PRV+LY294002组与同时间段感染未阻断PI3K/Akt信号通路组相比凋亡细胞明显增多,且随着感染时间的延长凋亡细胞明显增多。流式细胞检测结果显示,阻断PI3K/Akt信号通路后PRV感染TG细胞诱导的细胞凋亡数量明显增多,说明PI3K/Akt信号通路在抑制由于PRV感染后引起的TG细胞凋亡中发挥重要作用。