水稻白条纹突变体wm4的鉴定及基因定位

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水稻是全世界最主要的粮食作物,其产量在全球粮食安全保障问题中起着无可替代的作用。而光合作用是水稻产量的关键因素之一,其效率的产出在很大程度上取决于水稻叶片的颜色,所以叶色突变体成为探求水稻光合作用效率的理想材料。目前,从已有报道的各种各样水稻叶色突变体中发现,蛋白的功能缺失或表达异常是导致这些叶色突变的主要原因。本研究主要内容包括:  ⑴wm4突变体属于高温敏感型突变体,该突变体在23℃、25℃和30℃这三个不同温度条件下表型有差异,在23℃、25℃下表现为正常或者白化不明显性状,在限制温度30℃条件下,突变体叶片在苗期出现明显白化现象,与野生型差异显著,但在分蘖盛期到抽穗期之间,叶片开始转绿,主叶脉依旧为白色。将该白脉突变体暂命名为white midrib4(wm4)。叶绿素含量测定表明,突变体在苗期的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和叶绿素总量都显著低于野生型植株,在抽穗期和成熟期都变现为差异不显著。叶绿体超微结构分析表明,突变体wm4与野生型相比,叶绿体数目减少,体积缩小,极少分化出明显的囊状片层结构,嗜锇小体的富集明显增多。但在抽穗期以后,突变体与野生型表型差异不大,叶绿体发育恢复正常。在大田种植条件下,经农艺性状考察数据得出,突变体除分蘖数显著降低,株高、穗长、结实率等相关性状差异不大。利用突变体与ZH-11杂交衍生的F2群体使用图位克隆技术将该突变基因定位在第4号染色体长臂上Indel1和Indel2之间约34kb的区域内。测序分析表明wm4突变体中一个编码调控钾离子运输蛋白质的释义基因Os04t0682800第四外显子内的一个碱基 G替换成了碱基 A,导致亮氨酸变成了苯丙氨酸。我们推测Os04t0682800为wm4(white midrib4)的候选基因。应用实时定量RT-PCR方法分析表明,苗期wm4表达量高,叶绿素合成hemal等相关基因表达量少,说明白叶确实叶绿素含量低,抽穗期wm4表达量降低叶绿体发育相关基因osppr等达量上调说明叶片转绿,成熟期光合作用相关基因psaA、psbA等相对于野生型表达量无明显差异,说明成熟后水稻光合作用不强。结果表明,wm4在水稻幼苗期叶绿素合成及叶绿体的发育中起重要的作用。  ⑵在经EMS诱变的中花11的突变体库中,又筛选到两个白条纹突变体wm4-2和wm4-3。这两个突变体同样苗期白叶明显在自养期开始后开始转绿变成白条纹。农艺性状考察发现:突变体的表型与wm4类似,与野生型比较结实率、千粒重无明显差异。对突变体与野生型进行光合色素和光合作用及相关指标测定发现,突变体相对野生型的光合色素和净光合速率都明显下降。基因初步定位于第4染色体长臂末端。然后,利用水稻基因组数据自行开发的SSR、Indel分子标记和F2群体突变体单株,最终将突变基因精细定位在Indel1和Indel2之间约34kb的区域内。通过基因分析与预测网站,发现该区间有6个开放阅读框。分别扩增测序野生型和突变体的这些基因,突变体wm4-2在基因Os04t0682800第一外显子内的一个碱基 G替换成了碱基 A,导致谷氨酰胺变成终止密码子,提前终止表达;突变体wm4-3在基因Os04t0682800第一外显子内的一个碱基插入导致移码,再次验证Os04t0682800为wm4(white midrib4)的候选基因。亚细胞定位结果发现WM4蛋白位于叶绿体中。
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