目的生物信息学分析分枝杆菌噬菌体Guo1裂解酶编码基因Lysin A,克隆表达分枝杆菌噬菌体Guo1裂解酶Lys A,纯化并观察该重组裂解酶对分枝杆菌属的抗菌作用,为开发治疗结核病的新型药物研究打下基础。方法1.生物信息学分析Guo1 Lysin A通过NCBI-BLAST对分枝杆菌噬菌体Guo1裂解酶编码基因Lysin A编码蛋白的结构域、3D结构进行预测;采用MEGA 7.0软件对分枝杆菌噬菌体Guo1裂解酶编码基因Lysin A与其他已知分枝杆菌噬菌体裂解酶编码基因进行同源构建。2.克隆、表达与纯化分枝杆菌噬菌体裂解酶Guo1 Lys A以分枝杆菌噬菌体Guo1 DNA为模板,设计引物P1/P2,PCR扩增Lysin A基因片段,Lysin A基因连入T克隆载体p MD20-T,通过Nde I/Xho I双酶切连接入原核表达载体PET28a,构建重组表达载体PET28a-Lysin A,转入感受态大肠杆菌BL21(DE3),筛选重组菌BL21(DE3)-PET28a-Lysin A,重组菌经诱导剂(IPTG)诱导表达。SDS-PAGE电泳分析重组蛋白的表达,重组蛋白经His-镍柱纯化。3.复性分枝杆菌噬菌体裂解酶Guo1 Lys A将纯化的分枝杆菌噬菌体裂解酶包涵体进行梯度尿素透析(使尿素终浓度分别为8M,6M,4M,2M,1M,0M,0M),并向透析液中分别加入,终浓度0.1%PEG2000,1m M EDTA,0.1m M GSSG,1m M GSH,0.6m M L-arginine微量元素。使包涵体蛋白得到正确折叠恢复其正确构象发挥其裂解活性,通过观察抗耻垢分枝杆菌作用探索其活性。4.分枝杆菌噬菌体裂解酶Guo1 Lys A的抗菌作用分别通过平板菌落计数法、刃天青显色法、扫描电镜观察裂解酶Guo1 Lys A对分枝杆菌及非分枝杆菌属的抗菌作用。结果1.生物信息学分析Guo1 Lysin A通过对分枝杆菌噬菌体Guo1裂解酶编码基因Lysin A进行生物信息学分析得知其具有编码肽链内切酶、酰胺酶的结构域,并通过预测得到其编码蛋白的3D结构。推测其编码的蛋白可能具有裂解酶功能,并将其基因序列及氨基酸序列与已知的几株分枝杆菌噬菌体裂解酶进行比对发现其具有不同来源性。2.克隆、表达与纯化分析分枝杆菌噬菌体裂解酶Guo1 Lys A经PCR扩增获得全长1316bp大小的Lysin A目的基因片段,经Nde I/Xho I双酶切连接构建得到PET28a-Lysin A重组载体,经PCR、测序验证表明重组载体构建成功,重组载体转入BL21(DE3)后,得到重组表达菌BL21(DE3)-PET28a-Lysin A,重组菌经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析提示约48.3k D表达分子量大小的蛋白条带,与预期蛋白大小相符。目的蛋白主要以包涵体形式表达,经His-镍柱纯化后得到较高浓度及较高纯度的Guo1 Lys A裂解酶。3.复性分枝杆菌噬菌体裂解酶Guo1 Lys A通过探索梯度尿素透析复性包涵体蛋白Guo1 Lys A的条件,将透析复性后的裂解酶作用于耻垢分枝杆菌,通过刃天青显色法、平板菌落计数法初步探索裂解酶对耻垢分枝杆菌的抗菌作用,发现复性后的裂解酶蛋白具有抗耻垢分枝杆菌的作用。4.分枝杆菌噬菌体裂解酶Guo1 Lys A的抗菌作用研究Guo1 Lys A经梯度尿素透析复性后,分别应用于抗耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌作用的研究。通过扫描电镜观察到经1mg/ml裂解酶Guo1Lys A处理的耻垢分枝杆菌形态变得肿胀、碎裂、溶解,而经1x PBS缓冲液处理的对照组耻垢分枝杆菌仍保持其细长弯曲、规则杆状的细菌形态;通过平板菌落计数法观察到经1mg/ml裂解酶Guo1 Lys A处理的耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌生长明显受到抑制,而经1x PBS缓冲液处理后的对照组培养板长满菌落;分别将刃天青显色剂添加入经裂解酶Guo1 Lys A处理的培养液和经1x PBS缓冲液处理的对照组培养液,发现经1mg/ml裂解酶Guo1 Lys A处理组的培养液仍保持天蓝色或者浅蓝色,说明无活菌生长或者存在较少菌量生长,而经1x PBS缓冲液处理后的对照组培养液变为粉红色,说明存在较多活菌生长。进一步,为了验证裂解酶对非分枝杆菌属的抗菌作用,选用了大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌作为受试菌,分别通过平板菌落计数法和刃天青显色法观察到Guo1 Lys A对上述菌群也具有抗菌作用,但较分枝杆菌属抗菌作用弱。结论分枝杆菌噬菌体裂解酶Guo1 Lys A可以通过原核克隆表达获得,其表达的蛋白经纯化、复性后显示其具有明显的抗耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌的作用,同时显示其较弱的抗非分枝杆菌属的作用。因此,分枝杆菌噬菌体裂解酶有望成为新型抗结核药物或制剂,为开发治疗新型抗结核研究打下基础。