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研究背景:龋病是一种高发的口腔疾病,影响身心健康的同时也会给家庭造成一定的经济负担。低龄儿童龋病(early-childhood caries,ECC)是指六岁以下儿童的一颗或多颗乳牙出现龋缺失或填补。2015年全国口腔流行病学调查数据显示5岁儿童患龋率高达71.9%,比十年前上升了5.9%。变异链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)是目前公认的重要致龋菌,其较强的生物膜形成能力和独特的产酸耐酸能力是导致龋病发生的主要原因。研究表明,不同龋患人群牙菌斑来源的变异链球菌毒力表达存在差别,但关于不同龋患人群特异性龋患位点牙菌斑来源的变异链球菌毒力和遗传特征比较国内外尚未见报道。目的:研究位点特异性牙菌斑来源的变异链球菌临床株的毒力和遗传特征。方法:本实验将不同位点牙菌斑来源的c血清型变异链球菌分为三组,ECC儿童龋坏位点组(ECC-C组)及其健康位点组(ECC-F组),无龋儿童健康位点组(CF组)。采集有龋和无龋儿童牙菌斑,每位有龋儿童提供两个位点的牙菌斑:龋坏牙面和健康牙面,有龋儿童其龋坏和健康牙面牙菌斑中同时分离出变异链球菌者被纳入。无龋儿童仅提供健康牙面的牙菌斑。1变异链球菌毒力表型检测有31名ECC儿童龋坏牙面和健康牙面牙菌斑中均可同时分离出变异链球菌临床株,这31名ECC儿童龋坏和健康牙面位点共分离出137株变异链球菌临床株。从16名无龋儿童健康牙面位点共分离得变异链球菌临床株28株。龋失补牙面数(decayed-missing-filled surfaces,dmfs)评分前十的10名ECC儿童的龋坏牙面和健康牙面的牙菌斑来源的变异链球菌临床株分别构成ECC-C组(n=23)和ECC-F组(n=23)。这16名无龋儿童所分离的28株变异链球菌临床株构成CF组(n=28)。分别通过比浊法、结晶紫染色法、刚果红染色法检测三组变异链球菌临床株的生长模式、生物膜态生物膜量、及生物膜态胞外多糖形成能力;并检测平台期初期p H值和生物膜上清液24小时p H值变化(△p H)。2变异链球菌毒力基因相对表达水平检测在已选择的10名ECC儿童中,随机选取这10名ECC儿童的龋坏牙面和健康牙面来源的变异链球菌临床株各1株构成ECC-C组(n=10)和ECC-F组(n=10);16名无龋儿童中随机选择10名,每个无龋儿童健康位点选择1株变异链球菌临床株构成CF组(n=10)用于相关毒力基因检测。通过实时荧光定量PCR检测毒力基因(gtf B,gtf C,spa P,srt A,rel A,ffh,srn225147,srn821798)的表达水平。以格氏链球菌(Streptococcus gordonii,S.gordonii)作指示菌株评估变异链球菌临床株变链素IV合成量,选取具有高变链素IV产量的变异链球菌临床株构成高-IV组(n=10),无变链素IV生成的变异链球菌临床株构成无-IV组(n=10)。通过实时荧光定量PCR检测变链素IV合成相关基因(com D,nlm A,nlm B)与s RNA srn225147的表达水平。通过电转化实验在变异链球菌UA159中上调、下调s RNA srn225147的表达,探索s RNA srn225147与com D基因及变链素IV合成的关系。3变异链球菌多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)检测所有龋坏牙面和健康牙面牙菌斑均可同时分离出变异链球菌临床株的31名ECC儿童均纳入本实验,并从这31名ECC儿童的两个牙面所分离出的变异链球菌中各筛选1株分别构成ECC-C组(n=31)和ECC-F组(n=31);16名无龋儿童中只有9名儿童在其健康位点分离有多株变异链球菌临床株,这9名无龋儿童纳入本实验,每位儿童随机选择2株变异链球菌构成CF组(n=18)。将入选的80株变异链球菌进行全基因组测序,并将测序的contig文件上传至Pub MLST,获得每个菌株相应的Do MLST等位基因型和序列型,并根据序列型结果构建进化树,以期分析不同位点牙菌斑来源变异链球菌的遗传特征。结果:1变异链球菌毒力表型三组变异链球菌在浮游态下的生长模式和平台期初期的p H值相似。生物膜态下,ECC-C组变异链球菌的生物膜量和△p H与ECC-F组相比没有显著差异(P=0.947;P=0.928),而ECC组(ECC-C和ECC-F)的生物膜量、△p H、胞外多糖量显著高于CF组(P=0.018,P<0.001 ECC-C和ECC-F与CF相比;P=0.017,P=0.046 ECC-C和ECC-F与CF相比;P=0.043,P=0.006 ECC-C和ECC-F与CF相比)。2变异链球菌毒力基因相对表达水平生物膜状态下,ECC组(ECC-C和ECC-F)的相关毒力基因(gtf B、spa P及srn225147)表达水平显著高于CF组(P=0.040;P=0.11;P<0.05)。s RNA srn821798的表达在三组间没有显著差异。s RNA srn225147过表达400倍时com D基因表达水平降低(P=0.019),而在过表达1400倍时com D基因表达水平升高(P=0.002)。但是s RNA srn225147过表达400倍与1400倍时变链素IV产生水平无明显差异。3变异链球菌MLST分析所有80株变异链球菌临床株共鉴定出了44个新的等位基因和77个新的序列型(Sequence Type,ST),94.44%的ECC组儿童ECC-C和ECC-F位点来源的变异链球菌共享相同的序列型,100%的CF组儿童一个健康牙面来源的两株变异链球菌序列型相同。结论:有龋儿童牙菌斑来源的变异链球菌的生物膜量、△p H、胞外多糖量及毒力基因表达水平显著高于无龋儿童。同一龋病儿童龋坏(ECC-C)和健康牙面(ECC-F)的变异链球菌毒力相似。s RNA srn225147对com D基因有微弱的双向调控作用,在变异链球菌致龋过程中的作用有待进一步探索。同一幼儿园中儿童口腔变异链球菌可能存在儿童与儿童间的水平传播。