论文部分内容阅读
本研究以‘海尔特兹’(Heritage)红树莓四个发育时期的(Rubus idaeus L.)果实为材料，利用电子鼻技术、气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术、基于RNA-Seq方法的从头组装转录组测序技术和qRT-PCR技术，对发育过程中的挥发性物质成分和含量的变化、挥发性物质差异基因注释到的相关代谢途径以及关键基因的表达差异情况等多层次进行了系统的研究，阐明了‘海尔特兹’红树莓果实发育过程中挥发性物质的变化规律、关键风味贡献物质以及实际感官特征变化的规律，明确了挥发性物质的相关代谢途径与关键基因的表达调控规律，为更好地调控和利用‘海尔特兹’红树莓果实的挥发性物质提供一定的理论依据。
本论文的主要研究内容及结果如下:
(1)利用HeraclesⅡ电子鼻对‘海尔特兹’发育过程中4个发育时期的红树莓果实所含的挥发性物质进行区分，结果表明:Period1-青果含有25种，Period2-黄果含有23种，Period3-红果含有22种，Period4-深红果含有23种。Period1-青果中包含8种关键风味物质，5种对总体风味具有修饰作用的物质;Period2-黄果中包含9种关键风味物质，4种对总体风味具有修饰作用的物质;Period3-红果中包含9种关键风味物质，6种对总体风味具有修饰作用的物质;Period4-深红果中包含5种关键风味物质，5种对总体风味具有修饰作用的物质;四个时期均含有的风味贡献大的物质有乙醛、丙醛、己醛、(Z)-3-己烯-1-醇、(E)-2-己烯醛、2-庚酮和α-紫罗兰酮这7种物质。随着发育程度的加深，红树莓果实挥发性物质中‘青香型’的气味占比逐渐下降，‘果香型’的气味占比逐渐增加，其他混合气味的占比逐渐增加。
(2)利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术，分析‘海尔特兹’发育过程中4个发育时期的红树莓果实所含的挥发性物质的变化规律，结果表明:‘海尔特兹’红树莓果实发育过程中共检测到了110种挥发性物质，其中，醛类10种、酮类17种、醇类9种、酯类16种、萜烯类26种、碳氢化合物20种、杂环类3种和其他9种。Period1-青果中含有32种，Period2-黄果中含有46种，Period3-红果中含有62种，Period4-深红果中含有71种，挥发性物质的种类随发育过程逐渐增加;其中，以醛类中的(E)-2-己烯醛为主的青草味挥发性物质的相对含量随发育过程逐渐降低。以酮类中beta-紫罗兰酮、alpha-紫罗兰酮和二氢-α-紫罗兰酮为主，酯类中乙酸甲酯和乙酸乙酯为主，萜烯类中1-石竹烯和α-萜品烯为主的果香味和花香味挥发性物质的相对含量随发育过程逐渐增加。红树莓果实发育过程中含量较高（大于1％）的挥发性物质，Period1-青果有14种，总相对含量为93.58％;Period2-黄果有16种，总相对含量为91.66％;Period3-红果有19种，总相对含量为87.16％;Period4-深红果有22种，总相对含量为83.37％;随着发育程度的加深种类数逐渐增加，相对含量逐渐减少。红树莓果实发育过程中各时期分别特有的物质，Period1-青果有6种，总相对含量为5.18％;Period2-黄果有9种，总相对含量为5.31％;Period3-红果有17种，总相对含量为6.08％;Period4-深红果有27种，总相对含量为15.71％;随着发育程度的加深，特有的物质种类数逐渐增加，相对含量也增加。
(3)利用基于RNA-Seq方法的从头组装转录组测序技术，分析‘海尔特兹’发育过程中4个发育时期的红树莓果实在转录组层面的变化，并对挥发性物质相关的结果进行分析可知:12个cDNA文库共获得528，910，176条Clean Reads，每个样品中的Q20均大于95％，Q30均大于93％，GC百分比范围为45-48％。拼接得到的205，880个unigenes中88.61％的unigenes能够被注释，具有最高物种相似性的物种是草莓。比较转录组分析注释到的所有差异基因数量:Period3vs Period2＞Period2vs Period1＞Period4vs Period3，对其进行注释筛选得到14个挥发性物质相关的KEGG途径分别是糖酵解/糖异生(ko00010)、柠檬酸(TCA)循环(ko00020)、磷酸戊糖途径(ko00030)、脂肪酸生物合成(ko00061)、脂肪酸降解(ko00071)、亚油酸代谢(ko00591)、α-亚麻酸代谢(ko00592)、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢(ko00250)、缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸降解(ko00280)、苯丙氨酸代谢(ko00360)、萜类骨架生物合成(ko00900)、二萜生物合成(ko00904)、倍半萜类和三萜类化合物的生物合成(ko00909)和类胡萝卜素生物合成(ko00906)，这14个KEGG途径比较组间的差异基因的数量:Period3vs Period2＞Period2vs Period1＞Period4vs Period3。其中四个关键的调控基因是PEPCK、GGPPs、PSY和CRTISO。PEPCK与萜烯类以及不同构型紫罗兰酮等挥发性物质的合成呈正相关，GGPPs与萜烯类以及不同构型紫罗兰酮等挥发性物质的合成呈负相关，PSY和CRTISO基因正相关不同构型紫罗兰酮等挥发性物质的合成。
(4)利用qRT-PCR技术，对四个关键的调控基因PEPCK、GGPPs、PSY和CRTISO进行表达量的分析，结果表明:PEPCK从Period1-青果发育到Period2-黄果的阶段表达量略微下降，在Period2-黄果发育到Period4-深红果的阶段表达量持续上升;GGPPs从Period1-青果发育到Period4-深红果的阶段表达量持续下降;PSY3和CR T1SO3从Period1-青果发育到Period4-深红果的阶段表达量持续上升。qRT-PCR验证结果中的表达模式与RNA测序结果一致。
本论文的主要研究内容及结果如下:
(1)利用HeraclesⅡ电子鼻对‘海尔特兹’发育过程中4个发育时期的红树莓果实所含的挥发性物质进行区分，结果表明:Period1-青果含有25种，Period2-黄果含有23种，Period3-红果含有22种，Period4-深红果含有23种。Period1-青果中包含8种关键风味物质，5种对总体风味具有修饰作用的物质;Period2-黄果中包含9种关键风味物质，4种对总体风味具有修饰作用的物质;Period3-红果中包含9种关键风味物质，6种对总体风味具有修饰作用的物质;Period4-深红果中包含5种关键风味物质，5种对总体风味具有修饰作用的物质;四个时期均含有的风味贡献大的物质有乙醛、丙醛、己醛、(Z)-3-己烯-1-醇、(E)-2-己烯醛、2-庚酮和α-紫罗兰酮这7种物质。随着发育程度的加深，红树莓果实挥发性物质中‘青香型’的气味占比逐渐下降，‘果香型’的气味占比逐渐增加，其他混合气味的占比逐渐增加。
(2)利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术，分析‘海尔特兹’发育过程中4个发育时期的红树莓果实所含的挥发性物质的变化规律，结果表明:‘海尔特兹’红树莓果实发育过程中共检测到了110种挥发性物质，其中，醛类10种、酮类17种、醇类9种、酯类16种、萜烯类26种、碳氢化合物20种、杂环类3种和其他9种。Period1-青果中含有32种，Period2-黄果中含有46种，Period3-红果中含有62种，Period4-深红果中含有71种，挥发性物质的种类随发育过程逐渐增加;其中，以醛类中的(E)-2-己烯醛为主的青草味挥发性物质的相对含量随发育过程逐渐降低。以酮类中beta-紫罗兰酮、alpha-紫罗兰酮和二氢-α-紫罗兰酮为主，酯类中乙酸甲酯和乙酸乙酯为主，萜烯类中1-石竹烯和α-萜品烯为主的果香味和花香味挥发性物质的相对含量随发育过程逐渐增加。红树莓果实发育过程中含量较高（大于1％）的挥发性物质，Period1-青果有14种，总相对含量为93.58％;Period2-黄果有16种，总相对含量为91.66％;Period3-红果有19种，总相对含量为87.16％;Period4-深红果有22种，总相对含量为83.37％;随着发育程度的加深种类数逐渐增加，相对含量逐渐减少。红树莓果实发育过程中各时期分别特有的物质，Period1-青果有6种，总相对含量为5.18％;Period2-黄果有9种，总相对含量为5.31％;Period3-红果有17种，总相对含量为6.08％;Period4-深红果有27种，总相对含量为15.71％;随着发育程度的加深，特有的物质种类数逐渐增加，相对含量也增加。
(3)利用基于RNA-Seq方法的从头组装转录组测序技术，分析‘海尔特兹’发育过程中4个发育时期的红树莓果实在转录组层面的变化，并对挥发性物质相关的结果进行分析可知:12个cDNA文库共获得528，910，176条Clean Reads，每个样品中的Q20均大于95％，Q30均大于93％，GC百分比范围为45-48％。拼接得到的205，880个unigenes中88.61％的unigenes能够被注释，具有最高物种相似性的物种是草莓。比较转录组分析注释到的所有差异基因数量:Period3vs Period2＞Period2vs Period1＞Period4vs Period3，对其进行注释筛选得到14个挥发性物质相关的KEGG途径分别是糖酵解/糖异生(ko00010)、柠檬酸(TCA)循环(ko00020)、磷酸戊糖途径(ko00030)、脂肪酸生物合成(ko00061)、脂肪酸降解(ko00071)、亚油酸代谢(ko00591)、α-亚麻酸代谢(ko00592)、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢(ko00250)、缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸降解(ko00280)、苯丙氨酸代谢(ko00360)、萜类骨架生物合成(ko00900)、二萜生物合成(ko00904)、倍半萜类和三萜类化合物的生物合成(ko00909)和类胡萝卜素生物合成(ko00906)，这14个KEGG途径比较组间的差异基因的数量:Period3vs Period2＞Period2vs Period1＞Period4vs Period3。其中四个关键的调控基因是PEPCK、GGPPs、PSY和CRTISO。PEPCK与萜烯类以及不同构型紫罗兰酮等挥发性物质的合成呈正相关，GGPPs与萜烯类以及不同构型紫罗兰酮等挥发性物质的合成呈负相关，PSY和CRTISO基因正相关不同构型紫罗兰酮等挥发性物质的合成。
(4)利用qRT-PCR技术，对四个关键的调控基因PEPCK、GGPPs、PSY和CRTISO进行表达量的分析，结果表明:PEPCK从Period1-青果发育到Period2-黄果的阶段表达量略微下降，在Period2-黄果发育到Period4-深红果的阶段表达量持续上升;GGPPs从Period1-青果发育到Period4-深红果的阶段表达量持续下降;PSY3和CR T1SO3从Period1-青果发育到Period4-深红果的阶段表达量持续上升。qRT-PCR验证结果中的表达模式与RNA测序结果一致。