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前言 皮肤损伤愈合是一个复杂而连续的过程，大致可分为三个阶段，即损伤后的渗出期、纤维增生期和修复期。有多种细胞因子和细胞成分参与皮肤损伤愈合过程，其中最重要的三种细胞成分为中性粒细胞、单核巨噬细胞及成纤维细胞。皮肤损伤愈合过程中的渗出期和纤维增生期损伤区内包括中性粒细胞、单核巨噬细胞及成纤维细胞等数量急剧增加，在修复期，损伤区内的细胞数量显著减少，直至伤口完全愈合。已有研究表明，皮肤损伤愈合过程中，这种细胞的增生与消亡，使细胞数保持平衡是通过细胞凋亡(apoptosis)机制来完成的。近来新发现一类细胞凋亡调节因子家族，即半胱氨酸天冬氨酸酶(cysteine aspartase)，现命名为caspase蛋白酶家族，目前已知该家族至少由14个成员组成(caspase-1～caspase-14)，caspase蛋白酶家族成员均以无活性的酶原形式存在于细胞质中。研究表明，当通过FAS或TNFR(tumour necrosis factor receptor)将凋亡信号传递至细胞内后，通过一系列级联反应激活caspase蛋白酶家族的某些成员，并裂解成二聚体而发挥效应。半胱氨酸天冬氨酸酶3、6、7(caspase-3、-6、-7)是该酶家族中导致细胞凋亡的最终效应因子。caspase-3、-6、-7被激活后，作用于细胞质成分，而使细胞发生凋亡。在皮肤损伤愈合过程中损伤及周边区内中性粒细胞，单核巨噬细胞及成纤维细胞是否表达caspase-3、-6、-7目前国内外尚未见研究报道。 本研究应用免疫组织化学技术，检测小鼠皮肤切创愈合过程中，caspase-3、-6、-7在损伤区及其周边区细胞，包括中性粒细胞，单核巨噬细胞及成纤维细胞中的表达，为进一步研究是否caspase-3、-6、-7是皮肤损伤愈合过程中，引起中性粒细胞，单核巨噬细胞及成纤维细胞凋亡的关键因子奠定基础，同时探讨不同损伤时间caspase一3、一6、一7的变化规律是否可作为推断损伤时间的指标。材料和方法 动物模型建立及分组:健康成年清洁级昆明系小鼠36只，每只重35一409，随机分为12组，每组3只，其中11组作为实验组，1组作为对照组。在背部中央做一纵行长Icm皮肤全层切口。分别于伤后oh、lh、3h、6h、12h、ld、3d、sd、7d、10d、14d行小鼠颈椎脱位处死，取伤口处1 .scm x 1 cm皮肤组织，对照组小鼠取相同部位同等大小皮肤组织作为对照。固定后石蜡包埋，连续5林m厚度切片。 casPase一3，一6，一7的免疫组织化学染色(sABC法):1.脱蜡、水化;2.3%过氧化氢PBS孵育20min，微波抗原修复;3.血清孵育，室温20 min。4.加人1:200倍稀释的一抗，25℃Zh;5.滴加生物素标记的山羊抗兔IgG抗体(casPase一6、一7组滴加生物素标记的兔抗羊IgG抗体)，25℃20而n;6.滴加SABC，25℃20而n;7.DAB显色1一3一5而n，苏木素复染、透明、中性树胶封片。easpase一6、一7多克隆抗体购自Santa Cruz Bioteehnolo盯Ine，casPase一3抗体及SABC试剂盒均购自于武汉博士德生物工程有限公司。 结果判断:caspase一3、一6、一7蛋白酶阳性表达均位于细胞浆。显微镜x 400倍率下，在每张切片中随机选择10个视野计数包括多核粒细胞、单核细胞及成纤维细胞的阳性细胞。计算每个视野中阳性细胞与此三种细胞总数的比值。 统计学分析:采用SPSS for诫nd~10.0软件包，应用方差分析进行统计学分析。实验结果 1 .Caspase一3、一6、一7在皮肤损伤愈合过程中损伤区及损伤周边区的表达: 对照组标本中，表皮基底细胞层、棘细胞层、颗粒细胞层以及真皮层皮脂腺和汗腺上皮细胞表达CasPase一3、一6、一7阳性。损伤组标本中，伤后Oh、lh组切片染色与对照组染色基本相同，3h组损伤区开始多核粒细胞浸润，并可见少量caspase一3、一6、一7阳性表达。伤后6h~ld组切片中，caspase一3、一6、一7阳性细胞主要为多核粒细胞及单核细胞。伤后3d和sd组，成纤维细胞大量增生，caspase一3、一6、一7阳性细胞主要为单核细胞和成纤维细胞。伤后7一14d，caspase一3、一6、一7阳性细胞以成纤维细胞为主。 2.阳性细胞计数及统计学分析: 2.1 caspase一3阳性细胞计数:伤后3h之内，caspase一3阳性细胞比率较低(4.53士6.53%)，6h组阳性细胞比率开始升高(24.17士1.76%)，在伤后3d阳性细胞比率达最高(62.66士4 .84%)，之后逐渐降低，14d阳性细胞比率下降到最低(21 .56土4 .54%)。 2.2 caspase一6阳性细胞计数:伤后3h之内，caspase一6阳性细胞比率较低(3.05士4.80%)，6h组阳性细胞比率开始升高(18.68土5.04%)，在伤后3d阳性细胞比率达最高(55.33土3.65%)，之后逐渐降低，14d阳性细胞比率下降到最低(21.26士4 .71%)。 2.3 caspase一7阳性细胞计数:伤后3h之内，caspase一7阳性细胞比率较低(4.60土6.74%)，6h组阳性细胞比率开始升高(22 .98土3 .49%)，在伤后3d阳性细胞比率达最高(52 .69士2.74%)，之后逐渐降低，14d阳性细胞比率下降到最低(19.52土2 .69%)。 2.4统计学方差分析:除oh组外，各时间相邻两组之间caspase一3、一6、一7阳性细胞比率相比均有显著差异(P<0