【摘 要】
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目的:人工合成一种模拟胰岛素样生长因子-2（insulin-like growth factor-2,IGF-2）活性功能区的多肽CW-703;研究其在体内、体外抑制眼部新生血管的有效性和安全性;并初步探讨其抑制新生血管的作用机制。方法:1.多肽的筛选、合成及鉴定:运用蛋白质序列比对、晶体三维结构分析,筛选出一段模拟IGF-2活性功能区的氨基酸序列;采用体外固相合成法合成CW-703多肽,并通过高
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目的:人工合成一种模拟胰岛素样生长因子-2（insulin-like growth factor-2,IGF-2）活性功能区的多肽CW-703;研究其在体内、体外抑制眼部新生血管的有效性和安全性;并初步探讨其抑制新生血管的作用机制。方法:1.多肽的筛选、合成及鉴定:运用蛋白质序列比对、晶体三维结构分析,筛选出一段模拟IGF-2活性功能区的氨基酸序列;采用体外固相合成法合成CW-703多肽,并通过高效液相色谱法和质谱分析进行分析鉴定。2.CW-703多肽抑制眼部新生血管的有效性和安全性研究:体外实验采用内皮细胞增殖实验、内皮细胞迁徙实验（划痕实验和Transwell小室实验）和管腔形成实验,验证CW-703多肽对血管新生的抑制作用;并通过MTS细胞活性实验和TUNEL方法评估CW-703多肽是否具有抑制细胞活性和促内皮细胞凋亡的作用。在体内,构建鸡胚尿囊膜（chick chorioallantoic membrane,CAM）和氧诱导视网膜病变（oxygen-induced retinopathy,OIR）模型,评价CW-703多肽在体内抑制新生血管的有效性;同时运用视觉电生理技术和光镜观察评价CW-703多肽对视网膜形态和功能的影响。3.CW-703多肽干预眼部新生血管的作用机制研究:在OIR模型中,运用Real-time PCR、Western blot和ELISA方法,检测CW-703多肽对视网膜内VEGF、PEDF、IGF-1、IGF-2和IGF-1R的mRNA及蛋白表达的影响;并运用Western blot法检测下游信号通路蛋白PI3K、Akt和ERK的表达,初步探讨CW-703多肽抑制眼部新生血管作用的细胞内信号传导通路。结果1.通过生物信息学方法筛选、经体外固相法合成一段含12个氨基酸的多肽CW-703,序列LCGGELVDTLQF,分子量1294.49 Da。2.在体外实验中,各浓度的CW-703多肽均能显著抑制VEGF诱导的HUVECs趋化作用;在划痕实验中,当浓度达到1μM或以上时,划痕区域的细胞未覆盖面积明显大于VEGF组;浓度≥100n M时,对VEGF诱导的HUVECs管腔样结构形成有明显抑制作用;在浓度达到100μM时,CW-703多肽对VEGF诱导的HUVECs增殖具有抑制作用;细胞活性实验和TUNEL实验中,CW-703多肽对细胞活性和细胞凋亡的影响与其他对照组相比无显著差异。在体内实验中,与高氧+PBS组相比,高氧+CW-703多肽组CAM无血管区域扩大;玻璃体腔注射CW-703多肽的OIR小鼠,视网膜中央无血管区面积和外围新生血管面积明显缩小;玻璃体腔注射CW-703多肽的大鼠,视网膜电流图各组b波波幅无明显下降。3.OIR模型中,与高氧+PBS组相比,高氧+CW-703多肽组的VEGF mRNA和蛋白表达量降低,PEDF mRNA和蛋白表达量增加;IGF-1 mRNA和蛋白表达量均增高;IGF-2的mRNA表达无变化而蛋白表达量下降;IGF-1R的mRNA和蛋白表达均无明显变化,但磷酸化IGF-1R蛋白表达量下降;PI3K、Akt和ERK蛋白总量无变化,磷酸化PI3K、Akt和ERK均下调。结论:在体外,CW-703多肽有效抑制了VEGF诱导的细胞增殖、迁移和管腔形成,对细胞活性和细胞凋亡无影响;在体内,CW-703多肽显著抑制CAM和OIR模型的新生血管形成;且对正常内皮细胞无毒性作用,不影响正常视网膜形态和功能。CW-703多肽抑制血管新生的作用机制可能与视网膜内磷酸化IGF-1R水平下调;细胞内信号通路PI3K/Akt和MAPK/ERK的活化受阻;同时VEGF水平下降伴随PEDF水平上升,血管促进因子和抑制因子间的动态平衡获得重建有关。
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