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酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)是哺乳动物体内黑色素合成的关键酶。筛选天然来源的酪氨酸酶抑制剂,为美白化妆品或以酪氨酸酶为作用靶点药物的开发提供依据。本研究从27种中药中筛选出了适宜灵芝发酵的黄芩,优化了添加黄芩的灵芝培养条件,并初步研究了灵芝发酵代谢产物的酪氨酸酶抑制活性。主要研究结果如下:1.以儿茶酚为底物,420 nm下邻苯二醌的生成与反应时间成正比,建立了体外分光光度法筛选酪氨酸酶抑制剂的测定体系,马铃薯酪氨酸酶的最适反应温度和最适反应pH分别为30°C和6.5。依据建立的酪氨酸酶测定体系,研究了27味中药水提物、以及27味中药经灵芝发酵后的酪氨酸酶抑制活性。6 g/L的中药经灵芝发酵后,黄芩、杨梅叶、绿茶、芦荟、桑叶和银杏叶较相同剂量的中药水提液的酪氨酸酶抑制率分别提高31.80%、21.2%、17.94%、17.57%、25.83%和14.29%,以黄芩的增幅最高;其中未添加中药的灵芝发酵液的酪氨酸酶抑制率为27.07%.2.利用正交试验L16(45)和响应面法优化了灵芝深层发酵产生酪氨酸酶抑制剂的培养基组成。确定的最佳培养基组成为:黄芩,6.3 g/L;麸皮,12.0 g/L;蛋白胨,6.0 g/L;玉米粉,15.6 g/L;葡萄糖,6.8 g/L;豆饼粉,11.3 g/L;磷酸二氢钾,1.5 g/L。研究了培养条件对灵芝发酵产生酪氨酸酶抑制剂的影响,确定的最佳培养条件为:培养温度,30°C;装液量:150 mL/500 mL三角瓶;摇床转速,125 rpm.优化的培养条件下,发酵液冻干粉浓度达到3.9 mg/mL时,最大酪氨酸酶抑制率为53.47%,与模型预测的酪氨酸酶抑制率52.87%相符。25.0 L反应器中的验证实验表明发酵时间120 h,最大酪氨酸酶抑制率为59.47%.3.研究了优化培养条件下,黄芩对灵芝发酵过程的影响。添加黄芩时,灵芝发酵过程的pH变化较未添加黄芩时缓和;灵芝发酵液的酪氨酸酶抑制活性显著提高。以芦丁为底物对灵芝转化黄芩的机理进行了探讨,研究中发现灵芝中的β-糖苷酶可能对芦丁转化为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷的过程起关键作用,由于糖基的去除,减少了黄酮与酪氨酸酶作用的空间位阻,增加了转化产物的酪氨酸酶抑制活性。4.对灵芝醇溶中性组分进行了GC-MS分析,检测到了匹配度为100%的灵芝甾醇,质谱中的主要离子碎片与化合物结构非常吻合。灵芝醇溶中性组分对酪氨酸酶的半数抑制浓度IC50约为1.10 mg/mL.5.测定了灵芝酸的酪氨酸酶抑制活性,初步推断灵芝酸对酪氨酸酶的抑制为反竞争性抑制。酶促反应动力学参数如下:酶促反应最大速度,Vmax=0.4367 min-1;米氏常数,Km=6.765 mmol/L;反竞争性抑制常数,Ki=9.036 mg/L (19.22μmol/L).灵芝酸对马铃薯酪氨酸酶的半数抑制浓度IC50为15.15 mg/L (32.23μmol/L),是五环三萜酸甘草次酸(IC50为50μmol/L)酪氨酸酶抑制活性的1.6倍。