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动物源食品安全是国际社会高度关注的重大公共卫生问题,引起食品安全问题的因素很多,其中70%以上的食源性疾病是由病原微生物引起的,主要由单核细胞增生李斯特菌、沙门菌、大肠杆菌、链球菌等引起。单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)是重要的人兽共患李斯特菌病的病原菌,能引起脑膜炎、胃肠炎、败血症及流产等症状,死亡率高达20%-30%。Lm具有耐受低温、高盐等特性,在环境、动物和食品加工环境中的广泛存在,对食品安全造成了重大影响。人李斯特菌病在欧美等国家多次暴发,其中不少是因为消费者食用了被污染的猪肉制品引起的。猪肉是我国人民消费量最多的动物产品,在猪肉的生产加工和销售过程中时常存在李斯特菌的污染,给人类的健康造成了潜在的威胁。因此弄清生猪屠宰过程中单核细胞增生李斯特菌的污染现状以及沿屠宰链传播的规律,有利于解决从农场到餐桌全产业链的动物源性食品安全问题。本研究对某生猪屠宰场不同屠宰环节的Lm污染情况进行调查,对分离到的Lm分离株进行基因组重测序,从基因组水平分析其种群结构、毒力等遗传进化关系,明确了 Lm在生猪屠宰链的传播特征及关键控制点,为企业制定相关措施控制Lm污染提供了理论支撑。1不同屠宰环节单核细胞增生李斯特菌的分离鉴定从屠宰场采集的936份样品中,有46份样品分离出Lm,分离率为4.9%。在刮毛、燎毛、去内脏、淋洗、人工修饰、喷淋预冷和冷藏排酸环节,以及地面、刀具等均能分离到Lm,其中冷藏排酸环节分离率最高(11.6%)。猪肉冷藏运输环节的78份样品中,有16份样品检出Lm,总检出率为20.5%。62株Lm分为4种血清型,其中血清型1/2a的菌株29株(46.8%)、血清型1/2b的4株(6.5%)、血清型1/2c的17株(27.4%)和血清型4b/4e的12株(19.4%)。综上所述,随着屠宰工序的进行,Lm的污染呈现逐级放大的趋势,冷藏环节Lm污染率最高,而冷藏排酸环节是Lm污染的关键控制点。对所有Lm分离株进行药物敏感性试验,结果显示有6株菌株对两种抗生素表现出耐药性(9.8%),其中有5株对氨苄西林和另一种抗生素耐药(克林霉素、环丙沙星耐药或青霉素);有20株菌株对氨苄西林耐药;3株菌株对克林霉素耐药;此外,对青霉素、环丙沙星、四环素、庆大霉素和复方新诺明耐药的菌株各有1株。所有分离菌株中,对一线药物氨苄西林的耐药率最高(32.8%),其次为克林霉素(4.9%),所有菌株对氯霉素、亚培安南、红霉素、链霉素、万古霉素和利福平均敏感。总之,该屠宰场猪源Lm分离株呈现耐药率大幅度上升、多重耐药菌株增加、耐药谱增宽的趋势。2基于基因组重测序的分子亚分型研究通过对61株不同来源的m分离株进行基因组重测序,在此基础上进行了多位点序列分型(Multi-virulence-locus sequence typing,MLST)、规律成簇的间隔短回文重复序列分型(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)、毒力相关基因和单核昔酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)分析,从基因组水平分析了Lm的遗传进化特性。MLST分型结果显示,所有Lm共分为6种ST型(Sequence type,ST)(3,8,9,121,155 和 626),其中优势 ST.型为 ST9(29 株),ST121(12 株)和 ST626(12 株),其他ST型包括ST3和ST8型的菌株各有4株,以及一株ST155的菌株。聚类分析结果显示,ST型与血清型之间具有较高的对应性,除ST9由血清型1/2a和1/2c的菌株构成之外,其他5个ST型分别对应一种血清型。屠宰场不同环节的分离株与运输环节的分离株之间具有相同的ST型,提示Lm是沿着屠宰环节及冷藏运输过程进行传播。基于CRISPR间隔序列的聚类分析结果显示,所有菌株分为2个进化分支(Cluster),其中Cluster Ⅰ由所有ST8、ST9和ST626型菌株以及1株ST121菌株构成,Cluster Ⅱ由ST3、ST121和ST155型菌株构成,每个分支中菌株的ST型高度一致,间隔序列也基本相同。值得注意的是,屠宰场分离到的ST626型菌株和ST155型菌株,分别形成了一个单独的进化亚分支。以上结果表明,CRISPR的聚类具有高度的多态性,能够根据间隔序列的差异实现亚型的区分,提示该分子亚分型方法对于研究菌株间的微进化具有重要意义。对重测序菌株的毒力基因分析发现,相同ST型的菌株携带的毒力基因基本相同,不同ST型菌株存在特定毒力基因型缺失的情况。所有ST3型的菌株只缺失inlF和vip两个毒力基因,而ST3型菌株具有引起人类李斯特菌病的倾向性,提示ST3菌株可能具有较强的毒力;ST8型菌株中缺失了另外的两个毒力基因htrA和vip;所有ST9型菌株均缺失了tcsA基因,且99%的分离株中缺失了 ami基因;而ST121型菌株却缺失了sipX、inlF、inlJ、actA和inlC共5个毒力基因。值得一提的是,ST155型的菌株携带有所有的83个毒力基因,提示该菌可能具有较高的毒力。以上结果表明,相同ST型的菌株毒力基因分布较为一致,而不同ST型菌株之间毒力基因有所不同,由此提示不同ST型菌株的毒力和潜在的致病风险有所不同。通过SNP分型对所有重测序分离株进行分析,结果显示所有菌株被分为两个不同的进化谱系(Lineage),分别为LineageⅠ和LineageⅡ,谱系LineageⅠ由ST3型分离菌株构成,而其他分离菌株则属于LineageⅡ,在相同分支上菌株的ST型高度一致,不同分支上菌株的ST型则不同。由SNP分型结果表明,不同环节的分离菌株存在于同一进化分支上,证明屠宰场的Lm主要是由活猪带入到屠宰场,从而进一步沿屠宰链进行传播。