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该研究内容包括三方面:(1)应用无特定病原体(SPF)鸡胚增殖禽流感病毒H1~H15标准毒株,提取病毒RNA,运用RT-PCR技术扩增标准毒株的HA、NA、NP、M和NS基因,克隆到PMD18-T载体上,转化JM-109感受态菌,获得阳性质粒,并进行了鉴定和序列测定.获得可以用来鉴别亚型的H1~H11、H13~H15HA基因,N1~N6、N8、N9亚型NA基因,以及用于型鉴定的NP、M和NS基因的阳性质粒,为基因芯片探针的制备奠定了工作基础.(2)建立一种可以鉴定流感病毒的A型和H5、H7、H9亚型RT-PCR方法,流感病毒血清型的确定通过扩增M基因的一段保守序列实现,获得阳性片bp;H5、H7、H9亚型的确认是通过扩增其血凝素保守序列获得,其片段大小分别为591bp、525bp、808bp.该RT-PCR方法用接种A/Turkey/England/N28/73(H5N2)、A/African starling/983/79(H7N1)和A/Turkey/Wiscosin/1/66(H9N2)病毒株的鸡胚尿囊液作阳性对照样品,扩增结果完全相对应.(3)参照AIV标准血凝素序列:Af144305(H5)、Af202232(H7)、D90305(H9),RT-PCR扩增保守区域具有HA亚型特异性三个靶DNA片段作探针,用来鉴别亚型,选择M、NS两个基因做阳性正对照靶DNA片段,空白质粒(pUC18)作系统阴性对照.点样,制备实验用小型芯睡.反转录中Cy-3标记,用cDNA产物与DNA芯片杂交,得到预期结果.该研究得到以下结论:1.对禽流感亚型代表毒株进行了分段克隆,获得了禽流感病毒的H1~H11、H13~H15亚型HA基因、N1~N6、N8~N9亚型NA基因,以及NP、M和NS基因的不同长度阳性克隆,经PCR及测序鉴定全部正确.2.首次获得N3亚型AIV的NA基因全序列,共1451bp,编码469个氨基酸.3.首次获得N4亚型AIV的NA基因编码全序列,共1442bp,编码470个氨基酸.4.首次获得A/Duck/Germany/1215/73(H2N3)、A/Turkey/Canada/63(H6N8)、PD384/79(H10N4)的HA基因序列,长度分别为1768,1737,1724bp,编码562,566,561个氨基酸.5.建立AIVH5、H7、H9亚型鉴别诊断的RT-PCR诊断方法.6.首次将基因芯片技术应用于AIV的诊断,为建立新诊断技术奠定基础.