目的:胃癌(Gastric cancer,GC)是世界范围第二大因癌症死亡的肿瘤。据统计每年有超过700000人死亡于胃癌。胃癌是在东亚、东欧与部分中东和南美洲地区最常见的消化道恶性肿瘤,其5年总生存率小于25%。尽管近年来对胃癌的治疗取得了进展,但胃癌的预后并不令人满意。因此,更好地了解控制胃癌发生和发展的分子机制和遗传调控网络有助于筛选潜在的诊断预后分子标志、确立新的治疗靶点。长链非编码RNA(lncRNAs)是一类具有转录长度大于200个核苷酸的非编码RNA。研究表明,lncRNAs参与多种生物学发生发展过程,包括染色质修饰、X染色体失活、转录、翻译、基因印迹、蛋白质活性的调节等多种生物学过程。lncRNA浆细胞瘤变异易位1染色体(PVT1)位于人类染色体8q24.21区,lncRNA PVT1在多种消化系统肿瘤表达异常,如结肠癌、肝癌、胰腺癌、食道癌。此外研究发现,lncRNA PVT1可能在癌症的发展起重要的调节作用,具有检测癌症疾病的预后价值。在这方面,lncRNA PVT1的生物效应和潜在的分子机制还需要进一步的研究。自噬是一个保守的途径,无论从酵母到人类,它都是一个重要的细胞内稳态的过程。自噬是自噬溶酶体形成并降解其所包裹内容物的过程。这个分解过程涉及多种自噬相关基因(ATGs),这些基因会影响自噬的激活。各种病理条件下,如缺氧、炎症和饥饿,自噬可以刺激帮助细胞在不利条件下生存。许多研究表明,自噬在肿瘤细胞的进展中起着重要的替代作用。在胃癌中,有几项研究表明,自噬可以广泛影响胃癌的病理表现。越来越多的研究发现,lncRNAs参与自噬的调节。但其中涉及的特殊机制仍不十分清楚,需要探讨。本研究的目的是通过TCGA数据库研究胃癌中lncRNA PVT1的表达模式,并研究在胃癌细胞的体外实验中lncRNA PVT1对细胞增殖,迁移、侵袭和细胞自噬的影响。目前的研究可能有助于了解胃癌lncRNA PVT1和自噬之间的调控机制。方法:1、研究人群及对象TCGA数据库下载胃癌组织与正常组织样本的基因表达谱数据。对349例胃癌患者的基因表达数据及相应的临床资料进行分析。lcnRNA PVT1表达进行归一化平均(RMA)算法。2、细胞培养选择三种胃癌细胞株(AGS、SGC-7901、BGC-823)和人正常胃细胞(GES-1)均购自ATCC。在37°C、5%CO2的条件下,使这些细胞在含10%胎牛血清(Hyclone)的RPMI 1640或DMEM培养基上生长(BioWhittaker)。3、细胞转染为了探讨lcnRNA PVT1的作用,我们分别构建lncRNA PVT1过表达细胞系以及敲除细胞系,将lcnRNA PVT1 cDNA(GenePharma)克隆到真核表达载体pcDNA3.1(Invitrogen,Carlsbad,CA)上,将载体及阴性对照转染到SGC-7901细胞上。将lcnRNA PVT1 siRNA及阴性对照转染至BGC-823细胞(GenePharma,Shanghai,China)上。4、实时定量PCR用Trizol试剂提取细胞总RNA。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit试剂盒(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)进行第一链cDNA与随机引物合成。使用SYBR Premix Ex Taq II(Takara,Dalian,China)及cfx96 PCR系统(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)进行实时定量PCR,并对结果进行归一化18s作为内部控制。5、细胞增殖在SGC-7901和BGC-823细胞转染质粒或si-lncRNA PVT1,MTT比色法测定胃癌细胞的增殖(Sigma-Aldrich,St Louis,MO,USA)。简而言之,将目的细胞在96孔板(1×10~4/孔),加入10 mL/孔的MTT(Sigma-Aldrich)。然后,我们将96孔板在37℃中孵育了4个小时。加入二甲基亚砜(150ml;Sigma Aldrich)溶解MTT。最终于490 nm处用吸光度法测定光密度。6、细胞克隆形成在六孔板上接种细胞(1000细胞/平板),培养两周,直至可见菌落出现。然后用结晶紫(Santa Cruz Biotechnology,Inc.)染色并对菌落进行计数。7、细胞侵袭实验24孔Millicell室含有Matrigel膜用于侵袭检测。迁移试验进行了类似的方式,无基质胶涂层。目的细胞(5×104)的顶部和底部都充满了完全培养基。将膜上表面的细胞擦拭干净,于膜下表面用甲醇固定,用0.1%结晶紫染色,计数五个随机场。8、蛋白印迹使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA(Roche,Nutley,NJ,USA)来裂解细胞。利用SDS-PAGE分离蛋白质样品,然后将蛋白质样本转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore,Billerica,MA,USA)。之后加入LC3[LC3B isoform,3868],p62蛋白、ATG5及β-肌动蛋白(Abcam,Hong Kong,China)进行孵育,并将形成的原发抗体在4℃并过夜。用ECL化学发光试剂(Pierce,Rockford,IL,USA)评估蛋白表达,然后利用密度(Image Lab software,Bio-Rad,Hercules,CA,USA)评估的蛋白条带,它是利用蛋白条带的定量评估并归一化到相应的β肌动蛋白条带。9、免疫荧光将细胞放入6孔板中,然后用磷酸盐缓冲盐水冲洗。加入4%多聚甲醛。然后,1抗体(1:100,specific for active LC3 and ATG5)加入培养4℃并过夜。然后洗三次(5分钟/次)。添加荧光抗体(1:100;Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)孵育2小时。洗三次(5分钟/次)。复染的细胞diaminophenylindole(Santa Cruz Biotechnology),用激光共聚焦显微镜观察。10、电子显微镜3%戊二醛固定SGC-7901和BGC-823胃癌细胞,在4℃条件下存储。用0.1M二甲酸钠缓冲固定细胞。然后在梯度为50–100%乙醇和环氧树脂包埋中对细胞脱水。之后制作超薄切片(50–60nm),用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色。使用jem-1400透射电子显微镜在80 Kv观察结果。11、数据分析SPSS13.0用的均值±标准差呈现数据,t检验分析差异性,差异标准是α<0.05。结果:1、在胃癌组织和细胞系中长链非编码RNA PVT1表达上调为了探索lncRNA PVT1在胃癌中的表达谱,我们使用STAD RNA-Seq数据从TCGA数据库下载lncRNA PVT1表达样本进行分析。结果表明,与正常组织相比,在胃癌组织PVT1显著上调。在研究关系lncRNA PVT1表达与临床分期关系上,我们根据分期将病例分为两组并进行表达谱分析。结果,III、IV期比I+II期的PVT1上调更显著。这一结果表明,lncRNA PVT1表达与高临床分期相关。为了评估在胃癌细胞系lncRNA PVT1表达水平,我们通过PCR对三株胃癌细胞系和一株正常胃上皮细胞系进行分析。结果发现,与正常胃上皮细胞系GES-1相比,lncRNA PVT1的表达水平在BGC-823,SGC-7901和AGS中较高。2、长链非编码RNA PVT1促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。我们之后研究了lncRNA PVT1水平对胃癌细胞增殖的影响。根据不同胃癌细胞系中lncRNA PVT1的表达差异水平,我们利用转染pcDNA3.1-PVT1载体技术在SGC-7901细胞过表达lncRNA PVT1。与对照组比较,lncRNA PVT1的表达水平显着增加了16.4倍。同时,我们下调BGC-823细胞(转染siRNA)中lncRNA PVT1的表达水平。在以下三种siRNA中,转染后降低lncRNA PVT1表达的效率为54%,其中si-PVT1也因此被用于后续实验中。用MTT法检测增殖效果,结果显示,过表达lncRNA PVT1促进SGC-7901增殖,而lncRNA PVT1表达降低则BGC-823增殖下降。为了进一步探讨胃癌细胞克隆体的生存能力,我们使用Colony-forming growth assays(集落形成生长法)进行研究,结果表明在SGC-7901细胞中过表达lncRNA PVT1而抑制BGC-823细胞的lncRNA PVT1拮抗体表达后胃癌细胞克隆体存活明显增加。此外,我们通过测试Transwell assays有无基底膜对胃癌细胞迁移和侵袭能力进行评估。结果显示,在SGC7901细胞中过表达lncRNA PVT1可以增加迁移和侵袭能力,然而在823细胞中抑制lncRNA PVT1表达则细胞迁移和侵袭能力下降,这表明lncRNA PVT1可以促进胃癌细胞的迁移和侵袭。鉴于上述,lncRNA PVT1可以促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。3、长链非编码RNA PVT1促进胃癌细胞自噬自噬是胃癌的保护因素,我们之后的研究目的在于lncRNA PVT1表达是否可以调节胃癌细胞自噬。我们首先利用蛋白印迹法Western blot检测自噬相关蛋白和P62水平。结果表明,在SGC7901细胞中过表达lncRNA PVT1后标志蛋白LC3II明显表达增加和P62下降,提示自噬通量活性提高。相反,在BGC-823细胞中lncRNA PVT1表达受抑制则观察到LC3II水平下降和P62增加,提示自噬通量受阻。进一步对胃癌细胞自噬lncRNA PVT1影响效果进行研究,使用免疫荧光法检测LC3II表达情况,结果与免疫印迹情况一致,而且据观察,LC3II表达主要在其细胞质中。然后,利用透射电子显微镜显示lncRNA PVT1高表达和低表达的细胞自噬发生情况,红色箭头为自噬体。与对照组相比,在SGC-7901细胞lncRNA PVT1过表达中自噬体更容易观察,同时,与对照组比较观察,BGC-823细胞中抑制lncRNA PVT1的表达,自噬体更难被观察。这些结果表明,lncRNA PVT1可以促进胃癌细胞自噬通量激活。4、长链非编码RNA PVT1通过与ATG5直接结合促进胃癌细胞自噬诱导ATG5表达ATGs在细胞自噬的调节作用是至关重要的。因此,我们利用PCR技术检测lncRNA PVT1诱导胃癌细胞自噬中涉及的一些与自噬相关蛋白基因的mRNA表达情况,包括ATG3、ATG5、ATG7,ATG10,Beclin和LC3B。结果表明,与对照组相比,ATG5增加近2.4倍。然后我们分别在过表达和抑制PVT1细胞中检测ATG5蛋白的表达。结果显示,与对照组相比,SGC-7901细胞PVT1过表达ATG5显著增加,抑制组ATG5表达减少。此外,通过免疫荧光法检测ATG5的表达,结果与免疫印迹一致,且据观察,在细胞质中也有ATG5表达。长链非编码RNA的一个重要功能就是与蛋白质结合,调节其表达。所以我们使用RIP检测lncRNA PVT1和ATG5之间的相互作用。结果表明,在胃癌细胞SGC-7901细胞中PVT1可以直接结合ATG5。总之,这些结果表明,lncRNA PVT1通过直接结合ATG5诱导ATG5表达进而促进胃癌细胞自噬。结论:综上所述,在TCGA数据库中,胃癌组织lncRNA PVT1明显上调,且lncRNA PVT1可以促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭,即癌基因的功能。深入探索机制发现,lncRNA PVT1可以通过上调ATG5的表达直接影响自噬功能,更深层的lncRNA PVT1激活自噬相关的详细机制需要进一步研究。