结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,近年来发病率逐年升高,5年生存率仍较低,肿瘤侵袭和转移是导致结肠癌患者死亡及影响预后的重要因素,但具体机制目前尚不清楚。近年来研究表明炎症微环境与肿瘤的侵袭和转移密切相关,慢性炎症可能是导致肿瘤侵袭和转移的重要原因之一。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)是肿瘤炎症微环境中的重要炎症细胞和促炎症细胞因子,研究发现它们诱导靶细胞DNA突变、恶性转化、细胞增殖以及血管增生,同时与肿瘤细胞的浸润和转移密切相关,促进肿瘤的进展。但TAMs和TNF-α如何介导结肠癌细胞浸润和转移有待进一步探讨。肿瘤相关钙信号转导蛋白-2(tumor-associated calcium signal transducer-2,TROP-2)是一种跨膜糖蛋白,目前发现多种人类上皮源性肿瘤中高表达,其与肿瘤的侵袭、转移和预后评估密切相关。但是结肠癌相关慢性炎症反应中TAMs和TNF-α高表达是否与TROP-2密切相关?炎症细胞因子TNF-α是否通过上调TROP-2而介导结肠癌细胞浸润和转移?目前仍不清楚。揭示这一作用机制,可能为采用生物靶向治疗方案抑制结肠癌细胞浸润、转移提供理论依据。在本研究中,我们检测结肠癌组织中TROP-2、TAMs和TNF-α的表达情况;并探讨慢性炎症因子TNF-α对结肠癌HCT-116细胞中TROP-2蛋白表达的影响及其在结肠癌细胞侵袭和迁移中的作用。第一部分结肠癌中TROP-2的表达及其临床意义目的:检测TROP-2蛋白在结肠癌标本组织及结肠癌细胞中的表达水平,结合临床病理资料探讨TROP-2与结肠癌进展的相关性及临床预后意义。方法:收集河北联合大学附属医院结肠癌患者的新鲜手术切除标本和病理石蜡切片,应用免疫组化染色法检测TROP-2蛋白在结肠癌组织、癌旁组织及正常结肠组织中的表达情况,回顾患者的临床资料,分析TROP-2蛋白水平与不同临床病理特征的相关性及临床预后意义。应用Western blot法检测TR0P-2蛋白在新鲜组织标本和结肠癌HCT-116细胞株中的表达情况。应用免疫荧光法观察TROP-2蛋白的定位情况。结果： 1免疫组化检测结肠癌组织中TROP-2蛋白的表达82例结肠癌组织中TROP-2蛋白阳性表达75例(91.5%),高表达55例(67.1%),低表达20例(24.4%);癌旁组织中TROP-2蛋白的阳性表达10例(12.2%),高表达2例(2.4%),低表达8例(9.8%)。正常结肠组织中基本无表达。结肠癌组织中TROP-2蛋白的表达强度明显高于癌旁组织和正常组织,差异有统计学意义(P<0.01)。2结肠癌组织中TROP-2的表达与各临床病理参数的关系结肠癌组织中TROP-2蛋白的表达与患者的性别、年龄、肿瘤分化程度无相关性(P>0.05),而与淋巴结转移情况及Dukes分期有显著相关性;伴淋巴结转移的结肠癌TROP-2的阳性率明显高于无淋巴结转移者,差异有统计学意义(P<0.05)。随着肿瘤Dukes分期的进展,TROP-2的阳性率逐渐升高,C+D期中TROP-2的阳性率明显高于A+B期,差异有统计学意义(P<0.01)。3激光共聚焦显微镜观察结肠癌组织中TROP-2的免疫荧光染色CLSM下观察荧光,细胞核呈红色,TROP-2呈环形绿色荧光,主要是肿瘤细胞膜表达,TROP-2在胞质内、细胞核则少量表达或不表达。正常结肠组织基本无TROP-2蛋白的绿色荧光表达,提示TROP-2在正常结肠组织中无表达。随着Dukes分期的进展,TROP-2的绿色荧光呈逐渐增多的趋势,提示随着肿瘤Dukes分期的进展,TROP-2的表达量逐渐升高。4 Western blot检测结肠癌组织中TROP-2蛋白的表达正常结肠组织、癌旁组织及结肠癌组织中均有TROP-2蛋白的表达,结肠癌组织中TROP-2蛋白的表达量明显高于癌旁组织和切缘正常组织,差异有统计学意义(P<0.01);伴淋巴结转移的结肠癌组织TROP-2的表达量明显高于无淋巴转移的结肠癌组织,差异有统计学意义(P<0.01);随着肿瘤Dukes分期的进展,结肠癌组织中TROP-2的表达量逐渐升高,各组比较差异有统计学意义(P<0.05)。5 Western blot检测结肠癌HCT-116细胞中TROP-2蛋白的表达TROP-2蛋白在结肠癌HCT-116细胞株中有明显的表达。故后续细胞水平的实验以结肠癌HCT-116细胞为实验模板。6结肠癌中TROP-2的表达与预后的相关性分析Kaplan-Meier生存曲线和Log-rank检验显示,TROP-2高表达组的5年生存率明显低于TROP-2低表达的患者(38.2%vs.63.6%),差异有统计学意义(卡方=34.520,P=0.005)。单因素生存分析结果显示TROP-2高表达(P<0.001)、淋巴结转移(P<0.001)、肿瘤Dukes分期(P<0.001)与术后的不良预后相关,多因素回归分析表明TROP-2蛋白的高表达(P<0.001,RR=17.209,95%CI:4.239-69.857)是结肠癌患者不良预后的独立因子。小结:结肠癌组织中存在TROP-2蛋白的高表达,其表达量与淋巴结转移、Dukes分期呈正相关,与预后呈负相关,TROP-2蛋白的表达水平可作为临床评价结肠癌病人预后的有价值指标。随着肿瘤Dukes分期的进展,结肠癌中TROP-2的表达量逐渐升高,提示TROP-2在结肠癌的侵袭和转移过程中可能发挥着重要的作用。第二部分结肠癌中炎症细胞TAMs和炎症因子TNF-a的表达及其与TROP-2的相关性研究目的:研究结肠癌组织中炎症细胞TAMs和炎症因子TNF-α的表达情况及其与临床病理特征间的相关性,并分析结肠癌中TROP-2与TAMs和TNF-α之间的相关性,旨在探讨结肠癌中TROP-2高表达与慢性炎症的相关性,为进一步探讨TNF-α/TROP-2在结肠癌细胞侵袭和转移中的作用机制提供理论依据。方法:选取河北联合大学附属医院病理科的结肠癌组织石蜡切片,应用免疫组化染色法分别检测肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达情况,回顾患者的临床资料,分析TAMs和TNF-α与各临床病理特征及预后的相关性,分析TROP-2与TAMs和TNF-α的相关性。结果： 1结肠癌组织中TAMs的免疫组化染色82例结肠癌组织切片中均可见CD68阳性巨噬细胞,CD68阳性巨噬细胞主要位于肿瘤间质内,正常结肠组织中无阳性细胞表达。结肠癌组织中TAMs计数明显高于正常结肠组织,差异有统计学意义(P<0.05)。随着Dukes分期的进展,结肠癌组织中TAMs计数逐渐升高。根据TAMs计数的中位数将本组病例分为高密度组和低密度组。2结肠癌组织中TAMs与各临床病理参数的关系结肠癌组织中TAMs浸润密度与患者的性别、年龄无相关性(P>0.05),与肿瘤分化程度、淋巴结转移情况及临床Dukes分期有显著相关性(P<0.05);伴淋巴结转移者TAMs浸润密度明显高于无淋巴结转移者(P<0.05)。随着Dukes分期的进展,TAMs浸润密度逐渐升高,其中B期与C期间的差异无统计学意义(P>0.05),其他各组的差异有统计学意义(P<0.01)。3结肠癌组织中TNF-α表达的免疫组化染色82例结肠癌组织中TNF-α阳性表达70例(85.3%),其中,高表达48例(58.5%),低表达22例(26.8%);切缘正常结肠组织中仅有少量TNF-α阳性染色颗粒。结肠癌组TNF-α的阳性率明显高于正常结肠组织,差异有统计学意义(P<0.01)。结肠癌组织中TNF-α的表达强度明显高于正常结肠组织。4结肠癌组织中TNF-α与各临床病理参数的关系结肠癌组织中TNF-α的表达与患者的性别、年龄无相关性(P>0.05),与肿瘤分化程度、淋巴结转移情况及临床Dukes分期有显著相关性(P<0.05);伴淋巴结转移的结肠癌中TNF-α的表达量及阳性率明显高于无淋巴结转移者,差异有统计学意义(P<0.05)。随着Dukes分期的进展,TNF-α的表达量及阳性率亦逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.01)。5结肠癌中TAMs和TNF-α与预后的相关性分析通过COX回归单因素分析及Kaplan-Meier生存分析发现,结肠癌患者总生存率与年龄、性别、肿瘤分化程度无关,而与有无淋巴结转移、肿瘤Dukes分期、TAMs的浸润密度以及TNF-α的表达相关。TAMs高密度组的五年的生存率是41.7%;而低表达组五年的生存率是61.5%,差异具有统计学意义(Log-rank检验,卡方=18.444,P<0.001)。TNF-α阴性组的五年生存率为83.3%,TNF-α高表达组的五年的生存率是42.9%;而TNF-α低表达组五年的生存率是69.7%,三组差异具有统计学意义(Log-rank检验,卡方=18.503,P<0.001)。Cox多因素分析结果显示TAMs浸润密度(P=0.189)和TNF-α表达量(P=0.284)均不是独立的预后因子。6结肠癌中TROP-2与TAMs、TNF-α表达的相关性分析在TAMs高密度组中TROP-2的阳性率为85.7%(36/42),而TAMs低密度组中TROP-2的阳性率为47.5%(19/40),差异有统计学意义(P<0.05);结肠癌组织中TROP-2蛋白的表达量与TAMs浸润密度呈正相关((rs=0.569,P<0.001);随着TAMs浸润密度的增加,TROP-2蛋白的表达量亦逐渐增加。TNF-α阳性表达的70例结肠癌中TROP-2的阳性率为94.3%(66/70),而TNF-α阴性表达组TROP-2的阳性率为66.7%(8/12),差异有统计学意义(P<0.05);TNF-α高表达的48例结肠癌中TROP-2的高表达率为91.7%(44/48),而TNF-α低表达的22例结肠癌中TROP-2的高表达率36.4%(8/22),差异有统计学意义(P<0.05);结肠癌组织中TROP-2的表达量与TNF-α的表达量呈正相关(rs=0.592,P<0.001);随着TNF-α表达量的增加,TROP-2蛋白的表达量亦逐渐增加。小结:结肠癌中存在炎症细胞TAMs的大量浸润和炎症因子TNF-α的高表达,二者均与结肠癌的进展相关,可作为结肠癌预后评估的有价值参考指标。结肠癌中TROP-2蛋白的表达与炎症细胞TAMs的浸润密度和炎症因子TNF-α的表达呈正相关,提示结肠癌中炎症细胞TAMs和炎症因子TNF-α可能参与TROP-2蛋白表达的上调。第三部分炎症因子TNF-α通过上调TROP-2表达促进结肠癌细胞侵袭迁移的体外研究目的:本部分研究旨在探讨炎症因子TNF-α对结肠癌HCT-116细胞中TROP-2蛋白表达的调控及其对结肠癌细胞侵袭和迁移能力的影响,探讨TNF-α是否通过调控TROP-2表达而影响结肠癌细胞的侵袭和转移。方法:体外培养人结肠癌HCT-116细胞株,首先应用不同浓度炎症因子TNF-α刺激结肠癌HCT-116细胞,MTT法检测药物对细胞增殖的影响,确定最佳药物浓度及作用时间。选择浓度为20ng/m L的TNF-α处理HCT-116细胞,用Western blot方法检测细胞中TROP-2蛋白表达量的变化,用划痕实验和Transwell实验检测低浓度TNF-α处理前后结肠癌细胞侵袭和迁移能力的变化。此外,应用RNA干扰技术沉默结肠癌HCT-116细胞的TROP-2基因,应用实时荧光定量PCR检测TROP-2m RNA及蛋白表达水平,再次检测低浓度TNF-α对低表达TROP-2蛋白的HCT-116细胞的侵袭和迁移能力的影响。结果： 1 TNF-α对结肠癌HCT-116细胞增殖的影响低浓度TNF-α(≤50ng/m L)处理24小时和48小时均对于HCT-116细胞无明显细胞毒性作用,细胞增殖无明显抑制。高浓度TNF-α(≥100ng/m L)则产生明显细胞毒性作用,对细胞增殖有抑制作用。故后续实验选择的TNF-α浓度为20ng/m L,作用时间不超过48小时。2 TNF-α对HCT-116细胞TROP-2蛋白表达的影响用不同浓度TNF-α(0、10、20、30、50、100、200ng/m L)处理HCT-116细胞24小时,用Western blot法检测TROP-2蛋白的表达,低浓度TNF-α(≤50ng/m L)处理HCT-116细胞24小时,TROP-2蛋白的表达量升高,其中以浓度20ng/m L时TROP-2表达量最高;而高浓度TNF-α(≥100ng/m L)时TROP-2蛋白的表达量逐渐下降。3 TNF-α对结肠癌HCT-116细胞侵袭和迁移能力的影响实验共分两组:TNF-α组(给予浓度为20ng/mL的TNF-α)和正常对照组(给予PBS代替TNF-α)。划痕实验结果显示,TNF-α组24h时的划痕愈合率较对照组显著增加,差异有统计学意义(P<0.01)。Transwell实验结果显示,TNF-α组中结肠癌HCT-116细胞的穿膜细胞数明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。4 TROP-2si RNA对HCT-116细胞TROP-2 mRNA和蛋白的影响实时荧光定量PCR及Western blot结果显示转染TROP-2si RNA后TROP-2基因的m RNA水平和蛋白水平均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。5 TNF-α对RNA干扰前后HCT-116细胞的迁移和侵袭能力的影响实验分为两组:si RNA组和正常对照组。划痕实验显示si RNA组与对照组相比,24h时的细胞划痕愈合率显著下降,差异有统计学意义(P<0.01)。Transwell实验显示si RNA组的穿膜细胞数较对照组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。小结:低浓度炎症因子TNF-α促进结肠癌HCT-116细胞侵袭和迁移的机制是通过上调TROP-2蛋白的表达来实现的。第四部分炎症因子TNF-α上调结肠癌细胞TROP-2表达的分子机制研究目的:旨在探讨MAPK信号通路在TNF-α上调TROP-2蛋白表达而促进结肠癌侵袭和迁移过程中的作用机制。方法:本部分实验以人结肠癌细胞株HCT-116为研究对象,选取三条MAPK信号通路为研究重点,体外培养结肠癌HCT-116细胞,给予浓度为20ng/m L的TNF-α处理(0min、15min、30min、1h、2h、3h)后,应用Western blot法检测三条MAPK信号通路中关键蛋白p-p38、p-JNK及p-ERK1/2的表达水平,确定可能被激活的信号通路。应用该激活通路关键蛋白的特异性抑制剂预处理HCT-116细胞30分钟,阻断该信号通路后,再给予炎症因子TNF-α处理,Western blot检测该通路关键蛋白及TROP-2蛋白的表达情况。再应用划痕实验和Transwell实验检测特异性抑制剂阻断该信号通路后能否影响TNF-α的促侵袭和促迁移能力。结果： 1浓度为20ng/m L的TNF-α处理结肠癌HCT-116细胞15分钟后即出现p-ERK1/2表达量的升高,差异有统计学意义(P<0.05);而p-JNK和p-p38的表达量无明显变化。2用ERK1/2通路的特异性抑制剂PD98059(20μM)预处理HCT-116细胞30分钟,特异性阻断ERK1/2通路后,再给予20ng/m L的TNF-α处理24小时,提取细胞总蛋白行Western blot,分别检测p-ERK1/2和TROP-2蛋白的表达量。实验共分四组:control组、PD98059组、TNF-α组和PD98059+TNF-α组。TNF-α组的p-ERK1/2和TROP-2的表达量均明显升高,而PD98059+TNF-α组的p-ERK1/2和TROP-2的表达量均明显低于TNF-α组,两组差异有统计学意义(P<0.05)。3划痕实验结果显示,PD98059+TNF-α组24h时的细胞划痕宽度较TNF-α组显著增宽,差异有统计学意义(P<0.05)。Transwell实验结果显示,PD98059+TNF-α组的穿膜细胞数较TNF-α组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。小结:在结肠癌HCT-116细胞中,低浓度炎症因子TNF-α是通过激活ERK1/2信号通路上调TROP-2蛋白的表达,进而促进结肠癌细胞侵袭和迁移。p38和JNK这两条MAPK信号通路在炎症因子TNF-α上调TROP-2蛋白表达过程中可能不发挥作用。结论:结肠癌中存在TROP-2蛋白的高表达,随着肿瘤Dukes分期的进展,其表达量逐渐升高,TROP-2蛋白可作为结肠癌预后评价的有价值指标。结肠癌中还存在炎症细胞TAMs的大量浸润和炎症因子TNF-α的高表达,随着肿瘤的进展,TAMs的浸润密度和TNF-α的表达量逐渐升高,二者与TROP-2的表达呈正相关,提示慢性炎症上调TROP-2表达可能是导致结肠癌侵袭和转移的原因。体外细胞培养实验发现,炎症因子TNF-α通过激活ERK1/2信号通路上调TROP-2蛋白的表达,进而增强结肠癌细胞的侵袭和迁移能力。进而提示在结肠癌相关慢性炎症反应中,炎症细胞因子TNF-α上调TROP-2表达促进癌细胞浸润和转移。