目的: 1．用大肠杆菌表达系统表达金黄色葡萄球菌蛋白 A，为研发免疫球蛋白纯化试剂、免疫学检测试剂等产业化商品奠定基础； 2．优化重组蛋白SPA在原核表达系统中的表达条件，并探讨有突变及8个氨基酸残基缺失的重组蛋白SPA生物亲和性变化。 实验方法: 1．SPA原核表达和鉴定 1．1 目的基因的选择：选择金黄色葡萄球菌的spa基因（NCTC8325株73429-74979bp），参考文献选择E、D、A、B、C五个结合功能域及X结构域片段，共1320bp。 1．2 扩增目的基因、构建克隆载体：根据spa基因序列在Primer5的辅助下设计引物。以金黄色葡萄球菌ATCC25923株基因组DNA为模板，PCR方法扩增目的基因，连接于pMD18-T载体获得克隆载体，转化感受态大肠杆菌Top10细胞，PCR鉴定阳性克隆。 1．3 SPA表达载体的构建：提取pMD18-T-SPA克隆质粒，与表达载体pET-30a同时以NdeⅠ、XhoⅠ双酶切，回收目的片段构建表达载体pET-30a-SPA，转化大肠杆菌BL21（DE3），PCR及双酶切鉴定并委托测序。 1．4 SPA重组蛋白的表达：挑取含重组载体的BL21（DE3）单克隆，终浓度为1mM的IPTG诱导表达5．5h，14000g/min离心5min收集菌体，SDS-PAGE法分析重组蛋白SPA表达情况。 1．5表达产物的鉴定及表达条件的优化：应用Western-blot方法鉴定目的蛋白，改变培养基成分、诱导温度、诱导时间、不同浓度诱导剂诱导表达，收集菌体SDS-PAGE法分析重组蛋白SPA最佳表达条件，在初步优化的基础上分析大量表达的最佳条件。 2．重组蛋白SPA生物亲和性研究 2．1 重组蛋白SPA的纯化：取含有重组载体的BL21（DE3）单克隆于Kana+LB培养基、30℃、终浓度为1mM的IPTG过夜诱导表达后14000g/min离心5min收集菌体。将菌体沉淀用结合液重悬，超声破碎细胞，应用His亲和层析纯化柱纯化目的蛋白，SDS-PAGE分析纯度。 2．2 SPA与多种属球蛋白亲性比较：以重组蛋白SPA包被酶标板，健康猪、人、山羊、兔、小鼠血清作为检测试剂，应用HRP标记的相应特异二抗-TMB显色系统获取A值，用SPSS统计分析软件进行t统计学分析，分析重组蛋白SPA的生物亲和特性。 3．灵敏度及特异性研究 3．1 HRP标记重组蛋白SPA：应用过碘酸钠法将HRP偶联到纯化的SPA上。 3．2 灵敏度分析：包被不同量人源IgG抗体，同时用SPA-HRP及羊抗人IgG-HRP检测，分析SPA-HRP检测IgG的灵敏度。 3．3 特异性分析：纯化后重组蛋白SPA包被酶标板，健康人血清及山羊抗人IgM-HRP、山羊抗人IgG-HRP为检测试剂，分析SPA与人源免疫球蛋白IgG结合的特异性。 实验结果: 1．SPA在大肠杆菌表达系统中得到表达 1．1 获得目的基因、构建了克隆载体pMD18-T-SPA：PCR方法获得SPA E、D、A、B、C功能域及X结构域1320bp核酸序列，菌液PCR鉴定成功构建了pMD18-T-SPA克隆质粒。测序结果显示目的基因序列与当前人们普遍才采用的与CowanⅠ株（Genbank M18264．1）比较，存在5个碱基突变（第371位C→T；第924位T→C；第934、935位G→A；第942位A→G），1075-1098（或1099-1122）缺失，氨基酸比对有2个氨基酸残基突变（124A→V；312 G→N）以及377-384氨基酸的缺失（由于X结构域存在多个重复序列，所以在推算过程中缺失序列可以处在不同的位置）。与Genbank H7531分离株（AM407348．1）比较，存在8个碱基突变（第371位C→T；第1005、1077位T→C；第1035位C→A；第1030、1031、1038、1044、1062位G→A），氨基酸比对有3个残基突变（第124位A→V；第344位G→N；第345位N→K）。 1．2 构建了表达载体pET-30a-SPA：pET-30a-SPA经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，电泳显示在5234bp、1320bp左右获得2条电泳带，大小与载体和目的DNA片段长度相符。 1．3 SPA重组蛋白的表达：挑取含重组载体的BL21（DE3）单克隆IPTG诱导表达后SDS-PAGE显示：阳性菌与阴性对照比较在46kD大小处出现条带，与目的蛋白大小一致；在35kD大小处的条带也有一条条带，可能为目的蛋白降解产物。 1．4 表达产物的鉴定及表达条件的初步优化：Western-blot结果显示，重组蛋白SPA得到了表达，但是存在降解现象。SDS-PAGE电泳结果显示，将宿主菌在不同浓度的诱导剂诱导下表达量没有明显改变；不同诱导时间分析表明5-6h重组蛋白SPA表达量最高；不同培养基分析DMEM培养基能明显减低目的蛋白的降解；诱导温度在25℃、25℃、30℃时蛋白降解也相对较低，在30℃条件下过夜诱导表达蛋白显示蛋白降解量较低，菌体产量高，表达量占菌体总量的26％左右，因此可以作为大量表达的条件。 2．重组蛋白SPA生物亲和性研究 2．1 重组蛋白SPA的纯化：应用His亲和层析纯化柱成功的获得了纯度约99％的重组蛋白SPA。 2．2 生物亲和性研究：ELISA实验分析发现重组蛋白SPA与人、小鼠源IgG有较高亲和性，而与猪、兔源IgG有亲和性较弱分别为小鼠的33．4％和31．5％，SPA与山羊源IgG未检测到亲和性，其A值与空白对照差异无统计学意义，P>0．05。 3．灵敏度及特异性研究 3．1 灵敏度分析：ELISA方法显示，SPA-HRP、羊抗人IgG-HRP均能检测到最低1ng水平的人源IgG，P/N值分别为2．612和2．8，表面两者在检测人源IgG时灵敏度相近。 3．2 特异性分析：ELISA方法分析显示，羊抗人IgG-HRP组A值与空白组比较差异有统计学意义，而羊抗人IgM-HRP组A值与空白组比较差异无统计学意义，P>0．05值，表明该重组蛋白SPA与人源IgG亲和力较高，但是与IgM基本无亲和力，因此在检测IgG时能保证较高的特异性。 结论 1．用大肠杆菌表达系统成功表达了重组蛋白SPA，降解现象也得到了有效解决。 2．经ELISA初步分析表明，重组蛋白SPA与人及小鼠源IgG有较高亲和力，而与兔及猪源IgG亲和力较弱，与山羊IgG无亲和力，与以往的研究资料有所不同，推测与A、D功能域氨基酸残基的突变及X结构域8个氨基酸残基缺失相关。