肝移植是肝病晚期患者唯一有效的治疗手段,自上世纪70年代我国进行第一台肝移植手术以来,肝移植技术经过近半个世纪的发展已经十分成熟,肝移植成功率与患者生存时间大幅提高。作为肝病患者延长生存时间最后的希望,肝移植手术数量并没有大幅上升,其中阻碍肝移植手术发展最大的困难是无风险正常供体肝的匮乏。在最近的研究中,各移植中心也在尝试应用传统认为具有风险的供体肝如脂肪肝供体,HBcAb阳性供体,肝纤维化供体,老年供体等边缘性供体（marginaldonor）。其中,老年供体肝源由于其供体多,来源广的特点成为研究者关注的重点。随着年龄增长,老年肝脏常伴随小幅度慢性应激过程,肝脏组织稳态逐渐失调,肝脏干细胞再生能力下降,肝脏逐渐进入老年状态。在世界多个移植中心的研究中发现,老年供体肝脏质量的下降是导致老年供体肝移植术后存活率降低的主要原因。因此,提高老年供体肝源状态,减少移植后肝功下降,提高肝移植成功率成为了现阶段老年领域和肝移植领域关注的重点。缩宫素（Oxytocin,OT）又被称为催产素,是机体下丘脑分泌合成的激素肽,进入血液系统后,通过血液运输到达靶器官如:子宫和乳腺,调节育龄期女性子宫收缩分娩和乳腺泌乳。除此之外,有研究发现缩宫素还能在中枢神经发挥作用,影响动物和人类的行为认知。缩宫素在其靶器官表面具有其特异性结合受体,称为缩宫素受体（Oxytocin receptor,OTR）。近几年的研究结果颠覆了传统对缩宫素的认知,研究发现缩宫素信号系统能够影响机体损伤调节,促进器官和组织的再生。缩宫素在外周器官的诸多作用显示其可能具有逆转衰老促进再生的作用。缩宫素对衰老器官的潜在逆转作用,让我们有理由怀疑缩宫素可能对老年肝脏具有促进作用。因此,在本课题中我们研究了缩宫素信号系统在人和小鼠肝脏中的表达和表达规律。观察了施加外源性缩宫素后,体内体外老年状态肝脏的变化。结合多种肝脏损伤模型探索了缩宫素对老年肝脏的作用。并初步探索了缩宫素信号系统逆转老年肝脏衰老的机制,希望找到一条改善老年肝脏质量的新途径。第一部分缩宫素在肝脏的表达目的:缩宫素作为下丘脑分泌合成的激素肽,通过血液系统运输作用于子宫和乳腺,调节育龄期女性子宫收缩分娩和乳腺泌乳。除此之外,有研究发现缩宫素还能在中枢神经发挥作用,影响动物和人类的行为认知。最近的一项研究还发现缩宫素受体在消化系统,免疫系统和循环系统表达,影响心脏、结肠、树突细胞和巨噬细胞的作用。而缩宫素信号系统在肝脏中的表达和作用目前仍不清楚。所以,在本研究中我们检测了缩宫素信号系统在肝脏中的表达及其表达规律,为接下来研究外源性缩宫素信号系统在老年肝脏中的作用提供理论基础。方法:1.蛋白质印迹法（Western blotting）检测小鼠正常肝细胞系（AML12）、青年和老年小鼠/人肝脏中各组分细胞缩宫素受体的表达。2.免疫组织化学（Immunohistochemistry）检测肝脏和子宫、大脑等阳性对照中缩宫素受体的表达。3.免疫荧光（Immunofluorescence technique）双染检测肝脏和肝脏亚组分中缩宫素受体和亚组分标志物的表达。4.酶联免疫吸附测定（Elisa）检测青年和老年小鼠/人血液中OT的表达。结果:1.Western blotting结果显示缩宫素受体在小鼠和人肝细胞中特异性表达,在肝脏非实质细胞和胆管细胞中不表达。2.免疫组织化学结果发现肝脏组织切片与脑、子宫组织等阳性对照组切片相比都表达缩宫素受体。3.Western blotting结果显示老年小鼠/人肝脏中缩宫素受体蛋白的表达比青年小鼠/人肝脏更低。4.免疫荧光双染显示缩宫素受体与肝细胞膜标志物CK-18在同一位置表达,缩宫素受体蛋白在肝细胞中属于膜蛋白。缩宫素受体与胆管细胞标志物SOX9双染显示,缩宫素受体只在肝细胞表达。5.酶联免疫吸附剂测定（Elisa）结果显示小鼠/人血清中缩宫素浓度随年龄的增长而降低。结论:缩宫素受体作为一种膜蛋白,在人和小鼠肝细胞中特应性表达。缩宫素信号系统表达具有年龄依赖性,其表达随年龄的增大而降低。第二部分缩宫素逆转老年小鼠肝脏损伤状态目的:最近一项研究发现缩宫素受体在消化系统,免疫系统和循环系统表达,影响心脏、结肠、树突细胞和巨噬细胞的作用。其中研究结果表明外源性缩宫素能够促进心脏缺血再灌注后心脏细胞的代偿性修复,还能逆转老年小鼠肌肉萎缩状态,促进肌纤维修复。我们的前期研究结果发现小鼠和人肝脏中均存在缩宫素信号系统,且缩宫素受体与其配体在肝细胞中特异性表达并存在年龄依赖性,但缩宫素信号系统对肝脏的作用仍不明确。在本部分研究中,我们构建了老年小鼠部分肝切除肝损伤模型和四氯化碳（CCL4）肝损伤模型,用于检测外源注射缩宫素对老年肝损伤小鼠的作用。方法:使用2月和12月鼠龄的C57B/L雄性鼠,切除小鼠左右中叶肝脏,构建小鼠70%肝切除急性肝损伤模型并外源性腹腔注射缩宫素（0.1mg/kg.每4天）。处理20天后处死小鼠,记录小鼠剩余肝重量、相对肝重量和血清缩宫素水平。肝组织石蜡包埋切片通过HE染色对组织评分,评估外源性注射缩宫素对肝脏组织形态的影响。肝脏石蜡切片Ki67染色评估肝脏增殖情况。Western blotting和实时荧光定量PCR检测各组剩余肝脏中增殖指标Cyclin D1和增殖细胞核抗原（PCNA）的表达水平。使用2月和12月鼠龄的C57B/L雄性小鼠,通过腹腔注射10%CCL4（100ul/每只每天）建立CCl4诱导的化学慢性肝损伤模型,用药组每三天注射一次缩宫素（0.1mg/kg）。三周后处死小鼠,观察小鼠肝脏形态,称量小鼠肝脏重量和相对重量,检测小鼠血清中缩宫素表达浓度。通过肝脏石蜡切片HE染色评估肝脏组织形态变化。通过Ki67染色评估肝脏组织增殖情况。Western blotting和qPCR检测各组剩余肝脏中增殖指标Cyclin D1和PCNA的表达水平。通过酶联免疫吸附剂测定（Elisa）检测各组小鼠血清中肝脏损伤指标谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和CCL4代谢产物细胞色素P450同工酶（Cyp2E1）的水平。结果:肝部分切除肝损伤模型1.腹膜注射外源性缩宫素,青年和老年小鼠血清缩宫素浓度增加。2.连续注射外源性缩宫素20天后,缩宫素对年轻小鼠肝再生无显着影响。3.老年小鼠注射外源性缩宫素后剩余肝脏重量增加,相对肝脏重量增加。4.肝脏HE染色显示外源性缩宫素可以改善衰老小鼠肝脏状态。老年小鼠肝脏炎性细胞浸润程度降低,脂肪变性肝细胞减少。5.外源性缩宫素增强小鼠部分肝切除术后肝脏增殖和细胞周期,但对青年小鼠没有影响。CCL4诱导肝损伤模型1.实验组小鼠注射外源性缩宫素后血清缩宫素水平高于对照组或CCl4组。2.与对照组和缩宫素组相比,CCl4组肝脏肿胀,肝膜张力变大,肝脏表明粗糙并产生结节。3.HE染色显示,给药后与CCl4组相比,缩宫素组肝脏脂肪变性,肝索结构损伤和炎症反应降低。4.外源性缩宫素可以促进小鼠CCL4肝损伤后的肝脏细胞增殖,更多细胞进入细胞周期5.氨基转移酶测定试剂盒显示外源性缩宫素减弱了CCl4损伤引起的血清AST和ALT浓度。6.CYP2E1被认为是CCL4毒性的重要效应分子。在这项研究中,我们发现外源性缩宫素大大降低了老年小鼠血清中CYP2E1水平。结论:外源性缩宫素能够促进老年小鼠肝脏急性/慢性损伤后再生,对老年小鼠肝脏衰老状态有逆转作用。第三部分缩宫素通过自噬逆转肝脏衰老目的:自噬是机体处于正常或应激条件下维持机体稳态和内环境平衡的高度保守机制,也是真核生物体内细胞再循环利用细胞内成分的关键机制。自噬可通过溶酶体降解细胞内错误折叠的蛋白质或有缺陷的细胞器,并转化为各种基础成分加以循环利用。正常状态下机体饥饿、运动可引起自噬,当机体受到外界损害时,如:感染、氧化应激也可引起机体自噬。有观点认为,自噬的上调可减缓细胞衰老,而抑制自噬可促进细胞衰老。最近有研究发现,外源性缩宫素处理卵巢癌细胞系SKOV3和MDAH-2774后,癌细胞自噬水平升高,自噬相关蛋白Becline-1表达上调。该线索提示缩宫素可能影响机体自噬水平变化有关。在前期研究中我们发现,老年小鼠肝脏自噬标记物Becline-1、LC3Ⅰ/Ⅱ水平较低,随鼠龄增加而降低。以上重要线索暗示了缩宫素信号系统可能通过自噬影响老年肝脏再生。方法:首先我们检测了青年（2月鼠龄）小鼠和老年（12月鼠龄）小鼠肝脏组织中自噬水平。接下来,我们检查了外源性缩宫素对小鼠正常肝细胞系自噬活性的影响。通过小鼠肝脏大部切除/CCL4损伤模型,我们检测了外源性缩宫素对肝脏自噬的影响。结果:1.青年小鼠（2-3个月）与老年小鼠（12个月）相比肝脏自噬水平较高。2.外源性缩宫素提高了小鼠正常肝细胞系（AML12）的自噬水平。3.体内研究结果（肝大部分切除肝损伤模型,CCl4肝损伤模型）证实,外源性缩宫素较青年小鼠相比大大改善了老年小鼠肝脏损伤后自噬活性。结论:以上结果表明外源性缩宫素信号系统可以提高肝脏内自噬促进衰老肝脏损伤后肝脏再生。