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乳腺癌是女性发生率高的恶性肿瘤,占女性恶性肿瘤的第二位。在我国,乳腺癌的病死率呈上升趋势。三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）是雌激素受体、孕激素受体,和人表皮生长因子受体均为阴性的一种特殊类型的乳腺癌,占乳腺癌的15到20%。由于缺乏有效的靶向治疗手段,使得三阴性乳腺癌（TNBC）的预后差,死亡率高。在三阴性乳腺癌中,表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EFGR）和受体酪氨酸激酶（c-Met）为异常高表达。EGFR（HER1）和c-Met这两种膜蛋白的高表达与TNBC肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,及耐药性密切相关。HER1和c-Met通过形成同源和异源二聚体,激活酪氨酸蛋白激酶活性,诱导下游蛋白磷酸化,从而启动下游信号通路,促进并调控肿瘤细胞的增殖、血管生成和肿瘤转移。HER1和c-Met是治疗TNBC的重要药物靶点,但目前它们在TNBC细胞膜上的定位、分布,及聚集态还不十分清楚。生物成像技术对生命科学领域中,细胞生物学、分子生物学、分子遗传学、肿瘤学、病理学,免疫学等研究起着重要作用。普通光学显微镜/荧光显微镜受到光衍射极限的限制,不能识别单一膜蛋白。电子显微镜具有纳米—原子尺度的空间分辨率,是识别生物超微结构的高分辨成像技术。本文采用了场发射环境扫描电镜（ESEM）,及基于ESEM自主构建的液体环境ESEM观测平台,实现了以单分子水平的分辨率,精确定位并量化分析了由纳米探针和荧光探针特异性标识的TNBC细胞EGFR（HER1）和c-Met膜蛋白的空间分布、聚集状态,及定量表达,获得如下结果。1、液体环境ESEM观测平台主要包括:自主构建的扫描透射成像装置（STEM-in-SEM）和液体芯片装置等。此外,结合高分辨阴极荧光（CL）谱仪,以及采用多种成像模式,包括扫描透射（STEM）电子像、二次电子（SE）像、背散射电子（BSE）像,及阴极荧光（CL）像。应用这些组合技术,以及多种电子和光子成像模式,研究肿瘤细胞的膜蛋白高表达特征。2、首次获得了TNBC细胞在液体环境扫描电镜中的高分辨像。精确识别了由ZnS@CdSe量子点（QDs）特异性标定的膜蛋白HER1。研究了HER1的择优分布,及聚集态,包括单体,二聚体和多聚体。液体环境STEM像的分辨率达到约7 nm,放大倍率达到400,000×。与传统扫描电镜的成像方式比,液体环境STEM成像方式提高了图像分辨率、像衬度及SNR,并降低了高能电子束对生物样品的辐照损伤。3、实现了高分辨、跨尺度观测由纳米金颗粒（Au NPs）特异性标识的HER1和c-Met在TNBC全细胞上的位置、分布,及聚集态。二次电子（SE）像和背散射电子（BSE）像的分辨率优于10 nm,放大倍率从50×到200,000×。4、首次获得HER1和c-Met的全细胞高表达分布图,及膜蛋白的定量表达（为20多个细胞,3000多幅高分辨像,及约一百万个蛋白的统计数据）。1)HER1和c-Met在细胞边缘的表达量增多;2)HER1在细胞边缘皱褶区的表达量明显高于边缘平坦区;3)HER1单体、二聚体和多聚体在全细胞上的表达量分别约为:40%,12%,及48%。获得的膜蛋白二聚体的择优分布特征和定量数据,为研究二聚体的下游功能和细胞内的信号传导机制,提供了准确的定位信息及药物靶点。5、施加配体诱导TNBC细胞,调控TNBC膜蛋白c-Met的聚集状态,促使c-Met二聚体高表达。这为研究二聚体的下游功能、蛋白之间的相互作用,肿瘤细胞对药物的反应提供了精准的可视化信息。6、首次获得了由荧光探针转染的TNBC细胞在液体环境中的高分辨阴极荧光（CL）像。探测到由红色荧光探针（Cy5）特异性转染的TNBC细胞边缘为荧光量子产额高的位置。这与由QDs和Au NPs探针标识的HER1在电子像（STEM、BSE,及SE像）中的高表达相符合。此外,CL像清晰地显示出由增强型绿色荧光蛋白（EGFP）探针和蓝色荧光（DAPI）探针转染的肿瘤细胞亚结构。CL像具有约10 nm的分辨率,是识别细胞亚结构至单一膜蛋白的高分辨荧光成像技术。7、采用了不同类型材料作为细胞爬片的衬底。包括:采用液体芯片的Si3N4薄窗口做衬底,获得溶液中膜蛋白的高分辨STEM像。采用ITO导电玻璃做衬底,消除了细胞等生物样品的荷电效应,提高了成像质量。采用具有表面等离子共振（SPR）增强效应的SiO2-Au@Si复合膜做衬底,提高了阴极荧光（CL）的量子产额。本文采用高分辨环境扫描电镜,以整体肿瘤细胞为研究对象,对了解膜蛋白高表达肿瘤细胞的发生和发展,研究其病变特征和机理,以及研发靶向药物具有现实意义。本文研发的液体环境STEM-in-SEM成像技术,为解决细胞生物学领域的科学问题提供了一种高分辨可视化研究方法和观测平台。同时,也为进一步发展肿瘤细胞在其自然状态和/或近生理环境中的高分辨成像技术奠定了基础。